Technologies in molecular biology for genomics and personalised medicine focused on PCR with reverse hybridization

Metody biomedicínského výzkumu, používané pro vyšetřování genetických variant, rizikových pro různá onemocnění, jsou používány spíše pro výzkumné účely, protože jejich klinická hodnota a efektivnost nákladů jsou diskutabilní. Není jasné, které metody nejpravděpodobněji poskytnou klinický přínos, a to zejména vsouvislosti spersonalizovanou medicínou. Cíl této práce bylo vyšetřit mutace související skardiovaskulárními chorobami stanovené za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) s reverzní hybridizace a posoudit vztah těchto genetických variant zhlediska rizika vzniku kardiovaskulárních onemocnění. Dále byly posuzovány: opakovatelnost, kvalita a reliabilita tohoto stanovení. Postup zahrnoval izolaci DNA, PCR amplifikaci, hybridizaci na proužku obsahujícím vázano alelově specifickouoligonukleotidovou sondu. Krevní vzorky pocházely od 18 pacientů sdyslipidemií a od 16 zdravých osob kontrolního souboru bez historie kardiovaskulárního onemocnění. Bylo analyzováno 8 genů a jejich genetických variant (eNOS-786T-C a G894T; LTA C804A; ACEins/del; GP IIIa (HPA1) a/b; beta-FBG-455G-A; ApoB R3500Q; APOE E2/E3/E4). Získaná data byla analyzována pomocí programu SPSS pro Windows. Homozygotní forma eNOS-786T-C byla nalezena pouze u pacientů. GP IIIa (a/b) se častěji objevovala u pacientů (85,71%) než u kontrolního souboru (14,29 %). ApoB R3500Q normozygotní forma byla nalezena pouze u kontrolního souboru, zatímco u pacientů se objevila jak normozygotní forma, tak heterozygotní forma. Heterozygotní forma ApoB R3500Q vykazuje dědičný rys. Vpětičlenné rodině se heterozygotní forma ApoB R3500Q objevila u otce a tří synů, ale ne u matky. ApoB R3500Q se také ukázalo jako nejsilnější nezávislý rizikový faktor dyslipidemie a kardiovaskulárních onemocnění. Byla nalezena silná korelace mezi dyslipidémií a GP IIIa a ApoB mutacemi. Ve zkoumané rodině byly alelové četnosti ENOS-786 T-C (75 %; 25 %); ENOS G894T (75 %; 25 %); LTA C804A (100 %; 0 %); ACE I/D (100 %; 0 %) a Apo E2/E3/E4 (0 %; 100 %; 0 %) srovnatelné spublikovanými literárními údaji, zatímco četnosti GPIIIa (75 %; 25 %) BFG ?455G-A (75 %; 25 %) a Apo B R3500Q (63 %; 37 %) byly nižší ve srovnání sliterárními údaji.Methods in biomedical research which are used for investigating genetic variations that may be linked to disease susceptibility are considered experimental because their clinical value and cost-effectiveness is controversial. It is not clear which methods are most likely to offer clinical benefit especially in the context of personalized medicine. The aim of this work was to investigate mutations associated withcardiovascular diseases using polymerase chain reaction (PCR) followed by reverse hybridization; and to evaluate the implication of the results on cardiovascular disease susceptibility. In addition, the repeatability, quality and reliability of the assay were assessed. The procedure involved DNA isolation, PCR amplification using biotinylated primer and amplification products hybridization to a teststrip containing immobilized allele specific oligonucleotide probes. Blood specimens from 18 dyslipidemic patients and 16 healthy controls with no history of cardiovascular disease were used. Eight genes and their variants (eNOS-786T-C and G894T; LTA C804A; ACE ins/del; GP IIIa (HPA1) a/b; beta-FBG-455G-A; ApoB R3500Q; APOE E2/E3/E4) were detected. Data analysis was done using SPSS for Windows. ENOS -786T-C homozygous state was found only in patients, GPIIIa (a/b) was more in patients (85,71 %) than in controls (14,29 %); only wild type ApoB R3500Q was found in the controls while patients showed both wild type andheterozygous forms. The heterozygous form of ApoB R3500Q showed a hereditary trait. In a family of 5, heterozygous form of ApoB R3500Q appeared in the father and three sons, but not in the mother. It also appears to be the strongest independent risk factor for dyslipidemia and cardiovascular diseases. There seems to be a strong correlation between dyslipidemia and GPIIIa and ApoB mutations. In the family studied, the allele frequencies of ENOS -786 T-C (75 %; 25 %); ENOS G894T (75 %; 25 %);); LTA C804A (100%; 0 %); ACE I/D (100 %; 0 %) and Apo E2/E3/E4 (0 %; 100 %; 0 %) were fair compared to published literature; while the allele frequencies of GPIIIa (75 %; 25 %);) BFG ?455G-A (75 %; 25 %) and Apo B R3500Q (63 %; 37 %) were lower than values in literature