MicroRNA-135a regulation of sodium calcium exchanger gene expression in cardiomyocytes

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of cardiac electrical and structural remodeling and are implicated in pathologies such as arrhythmias, ischemic heart disease and hypertrophy. miRNA expression has yet to be studied in the context of complete atrioventricular block (CAVB) and the subsequent bradycardic arrhythmogenic remodeling. A time course microarray and RT-qPCR analysis of left ventricular miRNA expression in a mouse CAVB model revealed a strong, early and sustained reduction in miR-135a over 4 weeks, a miRNA unexplored in the cardiovascular field. Several other miRNAs were differentially expressed by 4 weeks post-CAVB as well.To better understand the role of miR-135a in the cardiomyocyte, we identified relevant target genes using literature searches and prediction algorithms, followed by biological confirmation using miR-135a overexpression with luciferase assays, real time qPCR and Western blot. Na+-Ca2+ exchanger 1 (NCX1), encoded by the gene SLC8A1, was identified as a regulated gene; miR-135a overexpression reduced NCX1 3'UTR luciferase reporter activity (-42%) and NCX1 mRNA (-47%) and protein (-35%) expression. Given the significance of NCX1 activity in automaticity and Ca2+ handling in neonatal cardiomyocytes, we sought to investigate the functional effects of miR-135a overexpression in spontaneously beating primary neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs). 72-hour overexpression of miR-135a reduced spontaneous beating frequency at 33oC from 147±8 bpm (negative control) to 55±6 bpm, and caused beat-to-beat interval irregularities. Ca2+ transient measurements (fura-2 AM) demonstrated no miR-135a associated alterations when NRVMs were electrically stimulated at 2 Hz; however, rapid application of 20-mM caffeine revealed an increase in decay time constant (+54%) in miR-135a NRVMs. Additionally, the Ca2+ overloading toxic effects of 100-µM ouabain, a cardiac glycoside reliant on NCX1 activity, was eliminated by miR-135a overexpression, further reducing potentially arrhythmogenic spontaneous Ca2+ release events (SCREs). The findings of this study illustrate that miR-135a overexpression negatively regulates NCX1 expression, leading to alterations of NRVM automaticity, Ca2+ extrusion rate, arrhythmogenic Ca2+ loading and SCREs. miR-135a may contribute to pro-arrhythmic remodeling following CAVB.Les microARNs (miARNs) sont des régulateurs clés des remodelages électrique et structurel cardiaques et sont impliqués dans des pathologies telles que les arythmies, les cardiopathies ischémiques et l'hypertrophie. L'expression des miARNs n'a pas encore été étudiée dans le contexte d'un bloc auriculo-ventriculaire complet (BAVC) et du remodelage arythmogénique bradycardique subséquent. Une puce d'expression à miARNs et l'analyse individuelle par RT-qPCR de l'expression de miARNs du ventricule gauche au cours du remodelage post-BAVC chez la souris ont révélé une forte réduction précoce et soutenue de miR-135a sur 4 semaines, un miARN non étudié dans le domaine cardiovasculaire. Un certain nombre d'autres miARNs sont également différentiellement exprimés 4 semaines après le BAVC.Pour mieux comprendre le rôle de miR-135a dans le cardiomyocyte, nous avons identifié des gènes cibles pertinents en se basant sur des recherches bibliographiques et sur des algorithmes de prédiction. Nous avons confirmé ces études par des validations biologiques en étudiant les effets d'une surexpression de miR-135a avec des tests luciférase, de la qPCR en temps réel et de l'immunobuvardage de type Western. L'échangeur Na+ Ca2+ 1 (NCX1), codé par le gène SLC8A1, a été identifié comme un gène potentiellement régulé par miR-135a. La surexpression de miR-135a est parvenue à réduire l'activité du gène rapporteur Luciférase couplé à la séquence3'UTR de NCX1 (-42%) et réduit également l'expression de l'ARNm de NCX1 (-47%) et de la protéine (-35%).Étant donné l'importance de l'activité de NCX1 dans l'automaticité et l'homéostasie calcique dans les cardiomyocytes néonataux, nous avons cherché à étudier les effets fonctionnels de la surexpression de miR-135a dans des cardiomyocytes ventriculaires néonataux de rat (NRVM) ayant des battements spontanés. La surexpression de miR-135a durant 72 heures a permis de réduire la fréquence de battement spontané par minute (bpm) - enregistrée à 33°C - de 147±8 bpm (pour le contrôle négatif) à 55±6 bpm et a également provoqué des irrégularités de l'intervalle mesuré entre chaque battement. Les mesures des transitoires calciques (par la sonde fura-2 AM) n'ont pas montré d'altération associée à la surexpression de miR-135a lorsque les NRVM étaient stimulés électriquement à 2 Hz. Cependant, l'application rapide de 20 mM de caféine a révélé une augmentation de la constante de temps de décroissance des transitoires calciques (+54%) dans les NRVM surexprimant miR-135a. En outre, les effets toxiques d'une surcharge calcique par l'ajout de 100 uM d'ouabaïne, un glycoside cardiaque dépendant de l'activité de NCX1, ont été éliminés par une surexpression de miR-135a, réduisant davantage les événements de libération spontanés de Ca2+ (SCREs) potentiellement arythmogènes.Les résultats de cette étude montrent que la surexpression de miR-135a régule négativement l'expression de NCX1, entraînant des altérations de l'automaticité des NRVM, du taux d'extrusion du Ca2+ et de la charge calcique arythmogène, ainsi que des SCREs. miR-135a pourrait ainsi contribuer au remodelage pro-arythmique suite à un BAVC