Cambios funcionales en células proliferantes de Arabidopsis thaliana crecidas en ambientes de gravedad alterada

245 p.-97 fig.-18 tab.[EN] Gravity, a constant component of the terrestrial environment, affects numerous functions of living beings. Plant growth and development are vital functions which are founded on cellular processes such as cell proliferation and growth that occur in meristematic tissues, where "meristematic competence" consists of the strict coupling between the proliferative state of the cell and its growing capability. In previous studies, carried out in the International Space Station (ISS) and in a microgravity simulator on ground, our group has shown that the absence of gravity is capable of decoupling cell growth and proliferation in the root meristem. In order to consolidate and extend these previous studies, we have used a new device for simulation of altered gravity, based on the physical phenomenon of magnetic levitation and we have approached for the first time the effects of hypergravity on these biological processes, using both the Magnetic Levitator and the Large Diameter Centrifuge (LDC). Studies on the cell proliferation rate, nucleolar ultrastructure and the levels of nucleolar proteins, performed on samples grown under microgravity (0g*), confirmed the decoupling of cell proliferation and cell growth. Expression of the cyclin B1 gene, a marker of the G2/M transition in the cell cycle, evaluated by GUS staining on transgenic plants, decreased in 0g* despite the increase of the cell proliferation rate. Regarding hypergravity, moderate alterations recorded in these conditions in the two devices utilized indicate that the stress produced is weaker than under microgravity. Otherwise, since the sole influence of a high magnetic field was capable of altering plant growth and development, the effects of altered gravity detected in the Magnetic Levitator could have been somewhat masked by the magnetic field effects.In conditions of simulated microgravity, as well as under the influence of a high magnetic field, inhibition of the auxin polar transport was observed, according to the GUS staining pattern of the root of transgenic seedlings in which it was possible to visualize the expression of an auxin responsive gene. As a consequence, auxin was accumulated in the root tip and this could explain the higher proliferation rate in root meristematic cells in these conditions. However, hypergravity did not alter the auxin polar transport. With the purpose of testing whether cells not specialized in gravity perception respond to gravity alteration or not, and also for allowing the use of molecular techniques highly demanding in terms of biomass, we have used solid in vitro cell cultures, as a homogeneous proliferating cellular material. Changes detected either in gene expression and in the protein pattern at the level of the whole genome (studies based on microarrays and in bi-dimensional protein gels), or in specific genes (qPCR) and proteins (Westernblot), as well as the ultrastructural parameters of the nucleolus of cultured cells, reveal alterations in cell growth and proliferation which can be compared to those found in seedlings, indicating that at least a significant part of the response to altered gravity does not depend on specialized cells containing mechanoreceptors. On cell cultures we verified the alteration of the relative proportion of cell cycle phases (and probably also of the duration of the cycle), the change in expression of numerous genes acting as regulators in cell cycle checkpoints of phase transitions, and the deregulation of ribosome biogenesis by means of the alteration of nucleolar structure and of transcriptional and post-translational changes of key proteins of this process, such as nucleolin and fibrillarin. The intensity of alterations caused by the gravitational stress could be weakened by improving the seedling culture conditions with an increase of the energy supply (sugars), and it was strengthened by an amplified environmental stress caused by the synergy between the altered gravity and the high magnetic field. An additional contribution of this work has been the generation of transgenic plants in which a fluorescent signal (GFP reporter gene) is expressed under the control of either the cyclin B1 or the Nucleolin L1 gene promoter. Both of these are proteins of interest in the regulation of cell growth and proliferation. These plants will made possible to follow gene expression in real time, without the need of fixation, and will improve the efficiency and the yield of future space and ground-based experiments. Gravity alteration produces an atypical response, different from other plant responses to abiotic stress. Certainly, the gravity alteration is novel for plants, which throughout evolution, have had to face against different environmental changes, but never against the strength of the gravity vector. This could be the reason for the specificity of response to the gravitational stress.[ES] La gravedad es un componente constante del medio ambiente en la Tierra que condiciona numerosas funciones de los seres vivos. El crecimiento y el desarrollo de las plantas son funciones vitales que se fundamentan en procesos celulares como la proliferación y el crecimiento celular que ocurren en los tejidos meristemáticos, donde la "competencia meristemática" consiste en el estricto acoplamiento entre el estado proliferativo de las células y su capacidad de crecimiento. En estudios previos, realizados en la Estación Espacial Internacional (ISS) y en un simulador de microgravedad en Tierra, nuestro grupo ha mostrado que la ausencia de gravedad es capaz de desacoplar el crecimiento y la proliferación celular en el meristemo de la raíz. Para consolidar, extender y ampliar estos estudios previos hemos utilizado un nuevo dispositivo simulador de la gravedad alterada basado en el fenómeno físico de la levitación magnética y hemos abordado por primera vez los efectos de la hipergravedad sobre estos procesos biológicos, tanto en el Levitador magnético como en la Centrífuga de Gran Diámetro (LDC). Los estudios sobre la tasa de proliferación celular, la ultraestructura nucleolar y los niveles de proteínas nucleolares, realizados sobre muestras en microgravedad (0g*), confirmaron el desacople entre la proliferación y el crecimiento celular. La expresión de la ciclina B1, gen marcador de la transición G2/M del ciclo celular, evaluada mediante la tinción GUS en plantas transgénicas, disminuyó en 0g* a pesar del aumento en la tasa de división celular. En cuanto a la hipergravedad, las moderadas alteraciones detectadas en estas condiciones en cualquiera de los dos dispositivos utilizados indican que produce un estrés menos intenso para las plantas que la microgravedad. Por otra parte, la influencia de un campo magnético de alta intensidad alteró por sí sola el crecimiento y desarrollo de la planta, pudiendo enmascarar los efectos de la alteración de la gravedad detectados en el Levitador.En condiciones de microgravedad simulada, y también por efecto de un campo magnético elevado, se observó la inhibición del transporte polar de auxinas según el patrón de tinción GUS de la raíz de plántulas transgénicas en las que puede visualizarse la expresión de un gen inducible por estas hormonas. La consecuencia fue la acumulación de auxinas en la punta de la raíz, que podría ser responsable de la mayor proliferación celular en el meristemo radicular en estas condiciones. Sin embargo, la hipergravedad no alteró el transporte polar de auxinas. Con objeto de comprobar si existe respuesta a la alteración de la gravedad por parte de células no especializadas en su percepción, y también para permitir la realización de técnicas moleculares que demandan más biomasa, hemos utilizado cultivos celulares sólidos como un material celular homogéneo en proliferación. Los cambios detectados en la expresión génica y en el patrón de proteínas a nivel de genoma completo (estudios basados en microarrays y en geles bidimensionales de proteínas) o de genes (PCRq) y proteínas específicas (Western-blot), así como los parámetros ultraestructurales del nucleolo en los cultivos, revelan alteraciones del crecimiento y la proliferación celular comparables a las encontradas en plántulas, indicando que al menos una parte significativa de la respuesta a la gravedad alterada es independiente de las células especializadas que contienen mecanoreceptores. En los cultivos celulares se verificó la alteración de las proporciones de las distintas fases del ciclo celular (y probablemente de la duración del ciclo), el cambio en la expresión de numerosos genes reguladores que intervienen en los puntos de chequeo (checkpoints) de las transiciones entre fases, y también la desregulación de la biogénesis de los ribosomas, mediante la alteración de la estructura nucleolar y los cambios transcripcionales y post-traduccionales en proteínas claves del proceso, como nucleolina y fibrilarina. La intensidad de las alteraciones debidas al estrés gravitatorio pudo suavizarse mejorando las condiciones de cultivo al aumentar el aporte de energía; por el contrario, la sinergia entre la gravedad alterada y el alto campo magnético incrementó el estrés ambiental y la intensidad de las alteraciones. Un aporte adicional de este trabajo ha sido la generación de plantas transgénicas en las que una señal fluorescente (gen reportero GFP) se expresa bajo el control del promotor del gen de la ciclina B1 o de la nucleolina L1, dos proteínas de interés en la regulación de la proliferación y el crecimiento celular. Estas plantas posibilitarán el seguimiento de la expresión de estos genes en tiempo real, sin necesidad de fijación y mejorarán la eficacia y el rendimiento de futuros experimentos espaciales o en Tierra. La alteración de la gravedad produce una respuesta de estrés atípica, diferente de otras respuestas a estrés abiótico. Ciertamente, una alteración gravitatoria es una novedad para las plantas, que a lo largo de su evolución han debido afrontar diferentes cambios en condiciones ambientales, pero nunca en la intensidad del vector gravedad. Esta causa puede dar cuenta de la especificidad de la respuesta al estrés gravitatorio.Proyectos Multilaterales Europeos AYA2009-07952 y una ayuda del programa FPI Financiación de Ministerio de Ciencia e Innovación (Plan Nacional de I+D+i)Peer reviewe