Identificación de nuevos biomarcadores periféricos de deterioro cognitivo leve y enfermedad de Alhzeimer

NTRODUCCIÓN • Epidemiología de la Enfermedad de Alzheimer. El aumento de la esperanza de vida, debido en parte a los avances en este último siglo de la medicina moderna, da como resultado una mayor población de adultos mayores en nuestra sociedad. Junto a este aumento de la esperanza de vida, han aparecido enfermedades asociadas al envejecimiento, de entre las cuales destacan las demencias. Las demencias son las principales causas de dependencia, incapacidad y muerte en los adultos mayores (Reitz 2011, Cornutiu 2015). De hecho, la Enfermedad de Alzheimer (EA) es la sexta causa de muerte en Estados Unidos según la Alzheimer’s Association (2009). El término demencia describe un síndrome clínico adquirido, crónico y progresivo caracterizado por deterioro cognitivo, incapacidad para realizar las actividades de la vida diaria y alteraciones neuropsiquiátricas. La EA es la causa más común de demencia primaria, seguida por la demencia vascular y la demencia por Cuerpos de Lewy (Prince et al., 2013). El coste de cuidar a este elevado número de personas que padecen una demencia se incrementa cada año. De hecho se estima que en el año 2020 habrán 42.3 millones de personas que padecerán una demencia y este número puede aumentar hasta los 81.1 millones de personas en 2040 (Ferri et al., 2005). Según la OMS la mayoría de los países europeos gastan un 1% del PIB en demencias, especialmente en enfermeras internas o en residencias para ancianos (2012 WHO report “Dementia: a health priority”, Batsch y Mittelman 2015). • Anatomía patológica de la EA Así, la EA se caracteriza por dos lesiones anatomo-patológicas cerebrales fundamentales: la deposición de placas amiloideas por un mal procesamiento de Aβ y la formación de ovillos neurofibrilares. Las placas seniles son lesiones del neuropilo de forma esferoidal y de 20-100μm de diámetro, están constituidas por una zona central de amiloide rodeada de neuritas distróficas y de algunas células gliales. Las neuritas distróficas son prolongaciones de distintas neuronas que confluyen en una misma placa. El componente fundamental del amiloide cerebral es el Aβ, pero también se han encontrado otros componentes como inmunoglobulinas, factores del complemento, fibrinógeno o apolipoproteína E (ApoE). Las placas se encuentran repartidas por todo el encéfalo, predominando en hipocampo, corteza entorrinal y neocórtex (Duyckaerts et al., 2009). La otra lesión insignia de la EA son los ovillos neurofibrilares. Éstos están constituidos por filamentos helicoidales dobles, los cuales están compuestos fundamentalmente por la proteína tau y neurofilamentos anormalmente fosforilados que corresponden a proteínas que forman parte del citoesqueleto neuronal normal (Alberts et al., 2008). De forma normal, la proteína tau actúa de forma multimérica estabilizando los microtúbulos de las neuronas al formar puentes entre las fibras de tubulina; principalmente se encuentra en células del tejido nervioso como las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Alberts et al., 2008). En la EA esta proteína se hiperfosforila y conduce a un ensamblaje y desensamblaje alterado de los microtúbulos dando lugar un bloqueo en el transporte de orgánulos y proteínas en el citoplasma neuronal, en los axones y en las dendritas con su consecuente disfunción y degeneración (Ballard et al., 2011). Asimismo, la proteína tau hiperfosforilada en los axones y dendritas forma agregados intraneuronales, que a medida que se entrelazan con filamentos celulares aumentan de tamaño y generan ovillos neurofibrilares que inducen a la apoptosis celular. Estos ovillos son insolubles y se presentan como uno de los principales marcadores tisulares de la enfermedad (Ballard et al., 2011). Las regiones con más afectación son hipocampo, corteza entorrinal, neocórtex, complejo amigdalino y núcleos del prosencéfalo basal (Duyckaerts C et al., 2009). • Criterios diagnósticos y biomarcadores. Los criterios diagnósticos empleados por los profesionales para determinar la existencia de EA no tienen un origen común, pese a que la mayoría de éstos emplean las directrices establecidas por la United Status National Institute for Communicative Disorders and Stroke y The Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA) (Tierney et al. 1988). No obstante, hay que destacar que estos criterios, pese a ser los más empleados por los profesionales, no son únicos debido a la falta de consenso para dicho diagnóstico. La EA se diagnostica según dos criterios dados por el DSM-IV-TR (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition) y la NINCDS-ADRDA. Según estos criterios se considera que una persona padece EA cuando sufre una deficiencia de memoria y un impedimento extra en otro factor cognitivo que interfiere con su actividad diaria; sin embargo no defiende un diagnóstico definitivo hasta que se confirma histopatológicamente post mortem por lo que un paciente solo padece la enfermedad de forma “probable” (Dubois et al., 2007). En un intento de ir más allá de las directrices propuestas por la NINCDS-ADRDA Dubois et al. (2007) propusieron nuevos criterios para diagnosticar la EA que se basaban en un criterio diagnóstico principal [(pérdida progresiva de las funciones mentales superiores, fundamentalmente la memoria seguido de la capacidad lingüística)] y además un criterio de apoyo que reflejara la confirmación biológica in-vivo mediante los denominados biomarcadores. Los biomarcadores más estudiados en la EA son cinco y se dividen a continuación. Cada uno de ellos es un indicador de un proceso fisiopatológico concreto, por lo que es importante observar el conjunto de los mismos: Biomarcador de apoyo al diagnóstico mediante Imagen Atrofia cerebral mediante MRI estructural Hipometabolismo de la glucosa por FDG-PET PiB-PET Biomarcador de apoyo al diagnóstico mediante extracción de líquido cefalorraquídeo (LCR) Disminución de Aβ en LCR Aumento de tau y p-tau en LCR Está documentado que Aβ está disminuido en LCR en los individuos que padecen de EA y también en los que padecen un estadio previo denominado Deterioro Cognitivo Leve (DCL) (Craig-Schapiro et al. 2009, Hampel et al. 2010). Por otro lado, también se puede estimar la agregación del Aβ y su deposición mediante la tomografía por emisión de positrones o PET (del inglés, Positron Emission Tomography) empleando el compuesto de Pittsburg B (PiB) que se une a las placas ya agregadas de Aβ en el tejido. Hay que destacar que este compuesto solo se une al péptido no soluble ya depositado en placas amiloideas (Clifford et al., 2010, Dubois et al., 2010) Muchos estudios prueban que tau aumenta en LCR (Graig-Schapiro et al., 2009. Hampel et al., 2010. Clifford et al., 2010) y también tau fosforilada. Ambos marcadores son indicadores de daño neuronal y apoptosis. También se emplea para estimar este factor la técnica PET para medir la incorporación de fluorodesoxiglucosa (FDG), esto se considera una forma de medir el metabolismo cerebral y la actividad sináptica. En enfermos de EA se detecta una menor entrada de FDG en el cerebro que refleja una menor toma de glucosa y por ende, un menor metabolismo (Dubois et al., 2014). El uso de biomarcadores específicos permite el diagnóstico de la EA con mayor especificidad e incluso posibilita su determinación antes de que la enfermedad inicie los síntomas (Dubois et al., 2014). Este hecho hace que la necesidad de determinar formas de diagnóstico prematuro de los diferentes tipos de demencia sea uno de los grandes retos de la ciencia y la medicina en estos momentos (Ballard et al., 2011). Es interesante señalar que los biomarcadores están presentes en la práctica clínica diaria, pero con algunas limitaciones. Por ejemplo, los biomarcadores de imagen son costosos y las repeticiones están limitadas. El principal problema del uso de los biomarcadores en LCR es que implican una punción lumbar para la obtención de dicho líquido. Esta técnica es una técnica dolorosa con efectos secundarios tras el examen como migrañas y sangrados raquídeos. Es por ello por lo que la ciencia hoy en día está sumida en la búsqueda de biomarcadores periféricos, aquellos que se encuentren en el plasma o suero de los sujetos, porque es mucho más accesible, menos doloroso y menos costoso. En la presente tesis doctoral se remarcan en aquellas proteínas que pueden ser de interés para actuar como nuevos biomarcadores de EA. MATERIAL Y MÉTODOS Se reclutaron 22 pacientes diagnosticados con deterioro cognitivo leve (DCL) y 20 pacientes diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer (EA) siguiendo las recomendaciones de la NINCDS-ADRA. Todos los pacientes fueron diagnosticados en el servicio de Neurología del Hospital Clínico de Valencia por la Dra. Alonso. También se seleccionaron 24 sujetos sanos sin antecedentes de demencia que se sometían a una intervención con anestesia raquídea como grupo control. En todo momento se respetaron los principios fundamentales establecidos en la Declaración de Helsinki, en el consejo de Europa relativo a los derechos humanos y la biomedicina, en la Declaración de la UNESCO sobre el genoma humano y los derechos humanos, así como los requisitos establecidos en la legislación española en el ámbito de la investigación biomédica, la protección de datos de carácter personal y la bioética. Este proyecto fue aceptado por el Comité Ético del Hospital Clínico de Valencia. Los criterios de exclusión se detallan en el apartado Métodos de la presente tesis doctoral. Se realizó una punción lumbar siguiendo los procedimientos estándar. Se recogieron 12mL de líquido cefalorraquídeo en un tubo de poliprolileno y se transportó al laboratorio donde se procesaron todas las muestras. El LCR se centrifugó a 2000xG a 4ºC durante 10 minutos. Se recogió el LCR y el sobrenadante fue pipeteado y posteriormente se alicuotó en volúmenes 500 μl y se congeló a -80ºC hasta su uso en los análisis bioquímicos teniendo en cuenta los ciclos de congelación/descongelación. Aquellas muestras de LCR contaminadas con células sanguíneas en una cantidad superior a 500 eritrocitos/ml fueron descartadas del estudio. Las muestras de sangre fueron recolectadas en tubos para suero. En este caso se depositó la sangre en tubos sin anticoagulante durante 30 min aproximadamente, tras este tiempo la sangre se centrifugo a 1500 G durante 15 min y las muestras de suero se alicuotaron y congelaron a -80º C hasta su posterior análisis. La concentración de las proteínas de interés se llevó a cabo por ELISA (Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay) a través de un enzimoinmunoensayo tipo sándwich. La técnica de ELISA es una combinación que emplea la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de las enzimas para determinar la concentración de un antígeno concreto. Se utilizaron placas de 96 pocillos incubadas con un anticuerpo monoclonal humano contra la proteína que se pretende determinar. El tratamiento estadístico y el montaje de la base de datos siguió diferentes pasos: análisis descriptivo, los test de sensibilidad, ANOVA, realización de curvas ROC, análisis factorial y análisis discriminante. RESULTADOS • Proteínas determinadas en LCR: Aβ, tau y p-tau. Los niveles de Aβ disminuyen significativamente en los pacientes de DCL y EA. Tanto los pacientes del grupo DCL como los del grupo EA presentaron menores niveles de Aβ comparándolos con los sujetos del grupo control. La concentración de Aβ se correlaciona con la severidad de la enfermedad dado que el grupo EA presentó menores niveles de Aβ que el grupo DCL (p