Analysis of the molecular mechanisms that mediate the therapeutic actions of glucocorticoids in skin

Synthetic glucocorticoids (GCs) have been widely used for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases and exert their actions through binding to the GC receptor (GR) (Ramamoorthy and Cidlowski, 2016). GR is a transcription factor (TF) belonging to the nuclear receptor (NR) superfamily that mediates a wide range of important physiological processes (Sacta et al., 2016). Upon ligand binding, GR translocates to the nucleus and exert its actions either through binding to DNA or interacting with other TFs. Direct transcriptional regulation by GR involves its binding to specific DNA regulatory sequences called GC responsive elements or GREs. For a long time, it was postulated that GR induced their anti-inflammatory effects exclusively through transrepression by inhibiting known inflammatory pathways, including NF-B, AP-1 and MAPKs (Weikum et al., 2017). However, it is now accepted that transcriptional induction of several classic GRE-containing targets is also key for the anti-inflammatory actions of the GR (De Bosscher and Haegeman, 2009). Continuous treatment or high doses of GCs may lead to unwanted side effects (skin atrophy), which may have a big impact in population (Sacta et al., 2016). Therefore it is important to understand the mechanisms by which GR regulates transcription in skin and their impact on the therapeutic and adverse effects of GCs. In part I of this dissertation, we studied the regulation of GC-induced leucine zipper (Gilz/Tsc22d3) and Zinc Finger Protein 36/Tristetraprolin (Zfp36/Ttp), two primary transcriptional GR targets containing GRE binding motifs, in epidermal keratinocytes. These and other GC-targets were previously identified in our laboratory by GR ChIP-seq assays in which GRE, Krüppel-like factor (KLF), and AP-1 were the most overrepresented binding motifs. Given the relevance of GR and Krüppel-like factor 4 (KLF4) in skin, we have analysed the functional interactions between these TFs and their impact on Gilz/Tsc22d3 and Zfp36/Ttp gene expression. Loss of function experiments of GR and KLF4 demonstrated total GR but partial KLF4 requirement for full gene induction in response to dexamethasone (Dex). In calcium-induced terminally differentiatied keratinocytes, GR and KLF4 protein expression increased concomitant with Gilz/Tsc22d3 and Zfp36/Ttp up-regulation. However, GR-deficient cells failed to differentiate or fully induce Gilz, Zfp36 and Klf4 correlating with an augmented expression of Trp63, a known transcriptional repressor of KLF4 which is epithelium-specific. The identified transcriptional cooperation between GR and KLF4 may determine cell-type specific regulation and have implications for developing therapies for skin diseases. In part II of this dissertation, we have investigated GILZ, which has been shown to act as anti-inflammatory mediator in several cell types similar to GCs but without producing the GC-associated side effects. In contrast, little is known about the role of GILZ in skin function. Thus, we decided to study consequences of GILZ overexpression in psoriasis, an autoimmune inflammatory skin disease, where keratinocytes and immune cells play an important role. For this purpose we used an Imiquimod (IMQ)-induced psoriasis model in mice with generalized overexpression of GILZ (GILZ-Tg). Unexpectedly, GILZ-Tg showed more susceptibility to the IMQ-induced psoriasis, displaying more severe skin alterations shown by histological (increased epidermal hyperplasia and parakeratosis), and biochemical analysis (increased cytokine levels in serum and skin). Importantly, these alterations correlated with skin-specific overactivation of the TGF-β/SMAD signaling, which was recapitulated in cultured keratinocytes. Overall, these findings show that GILZ acts as a pro-inflammatory protein in skin in an IMQ-induced model of psoriasis and thus caution is advised in its therapeutic use.Los glucocorticoides (GCs) sintéticos han sido ampliamente utilizados para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes e inflamatorias y ejercen sus acciones mediante la unión al receptor de GCs (GR en inglés) (Ramamoorthy y Cidlowski, 2016). GR es un factor de transcripción (TF en inglés) que pertenece a la superfamilia de receptores nucleares que media importantes procesos fisiológicos (Sacta et al., 2016). Tras la unión del ligando, GR se transloca al núcleo y ejerce sus acciones mediante la unión a DNA o interaccionando con otros factores de transcripción. La regulación transcripcional directa por GR implica su unión a secuencias reguladoras de ADN específicas llamadas elementos de respuesta a GC o GREs. Durante mucho tiempo, se postuló que GR inducía sus efectos antiinflamatorios exclusivamente a través de la transrepresión mediante la inhibición de las vías inflamatorias conocidas, incluyendo NF-B, AP-1 y MAPKs (Weikum et al., 2017). Sin embargo, ahora se acepta que la inducción transcripcional de varias dianas clásicas que contienen GRE también es clave para las acciones anti-inflamatorias de GR (De Bosscher and Haegeman, 2009). El tratamiento continuo o altas dosis de GCs pueden producir efectos secundarios no deseados (atrofia de la piel), lo que puede tener un gran impacto en la población (Sacta et al., 2016). Por lo tanto, es importante comprender los mecanismos por los que GR regula la transcripción en la piel y su impacto en los efectos terapéuticos y adversos de los GCs. En la parte I de esta tesis se estudió la regulación de GC-induced leucine zipper (Gilz/Tsc22d3) y Zinc Finger Protein 36/Tristetraprolin (Zfp36/Ttp), dos dianas transcripcionales primarias de GR que contienen motivos de unión GRE, en queratinocitos epidérmicos. Éstas y otras dianas de GCs se han identificado previamente en el laboratorio mediante ensayos GR ChIP-seq en los que GRE, Krüppel-like factor (KLF), y AP-1 eran los motivos de unión más sobre-representados. Dada la relevancia de GR y KLF4 en la piel, hemos analizado las interacciones funcionales entre estos factores de transcripción y su impacto en la expresión de los genes Gilz/Tsc22d3 y Zfp36/Ttp. Los experimentos de pérdida de función de GR y KLF4 mostraron un requisito total de GR pero parcial de KLF4 para la completa inducción de genes en respuesta a dexametasona (Dex). En los queratinocitos terminalmente diferenciados inducidos por calcio, la expresión de la proteína GR y KLF4 aumentó coincidiendo con el aumento de Gilz/Tsc22d3 y Zfp36/Ttp. Sin embargo, las células deficientes en GR no lograron diferenciar o inducir completamente Gilz, Zfp36 y Klf4, correlacionando con el aumento de la expresión de Trp63, un conocido represor transcripcional de KLF4 que es específico del epitelio. La cooperación transcripcional identificada entre GR y KLF4 puede que determine la regulación específica del tipo celular y tiene implicaciones para el desarrollo de terapias para enfermedades de la piel. En la parte II de esta tesis, hemos investigado GILZ, que se ha demostrado que actúa como mediador antiinflamatorio en varios tipos celulares de manera similar a los GCs pero sin producir los efectos secundarios asociados a GC. Por el contrario, poco se sabe sobre el papel de GILZ en la función de la piel. Por tanto, decidimos estudiar las consecuencias de la sobreexpresión de GILZ en la psoriasis, una enfermedad autoinmune inflamatoria de la piel, en la que los queratinocitos y las células inmunitarias desempeñan un papel importante. Para ello, utilizamos un modelo de psoriasis inducido por Imiquimod (IMQ) en ratones con sobreexpresión generalizada de GILZ (GILZ-Tg). Inesperadamente, GILZ-Tg mostró más susceptibilidad a la psoriasis inducida por IMQ, mostrando alteraciones cutáneas más severas mostradas mediante histología (aumento de la hiperplasia epidérmica y paraqueratosis) y análisis bioquímico (niveles de citoquinas en suero y piel). Es importante destacar que estas alteraciones se correlacionaron con la sobreactivación de la señalización TGF-β/SMAD específica en la piel, que se recapituló en queratinocitos en cultivo. En general, estos hallazgos muestran que la GILZ actúa como una proteína pro-inflamatoria en la piel en un modelo de psoriasis inducido por IMQ y por lo tanto conviene tener precaución a la hora de considerar su uso terapéutico