Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares en especies del género Candida

Se ha desarrollado un método de obtención de exosomas, a partir de cultivos de levaduras del género Candida, que ha permitido obtener microvesículas de elevada homogeneidad y pureza. Mediante microscopía electrónica de transmisión y técnicas de detección de nanopartículas (NTA), se ha podido constatar la presencia de microvesículas de tamaños comprendidos entre 100 y 200 nm. La caracterización de proteínas llevada a cabo por técnicas de Western blot, ha puesto de manifiesto la elevada pureza de los exosomas obtenidos, no existiendo contaminación celular en las preparaciones, tal y como lo indican el resultado positivo frente a calnexina en el lisado celular y negativo en las vesículas extracelulares; positivo frente a enolasa en las vesículas extracelulares y negativo en el sobrenadante de ultracentrifugación; positivo frente a las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81, en las microvesículas y negativo en el lisado celular; positivo frente Hsp70, tanto en microvesículas como en el sobrenadante de ultracentrifugación y positivo, con elevada polidispersión frente a anticuerpos anti-pared, en las microvesículas. El tratamiento con Concanavalina A-ferritina, ha permitido detectar la presencia de manoproteínas en las microvesículas aisladas. El análisis proteómico, ha permitido identificar un elevado número de proteínas en los exosomas de las cuatro cepas analizadas, C. albicans SC5314 a 37ºC, C. albicans SC5314 a 28ºc y los mutantes glx3 y pir1, ambos crecidos a 28ºC, alcanzando un total de 985. De ellas, tan solo 181 se encuentran en los exosomas de C. albicans SC5314 a 37ºC, aumentando hasta 350 cuando se crece a 28ºC y hasta las 932 en el caso del mutante pir1, lo que pone en evidencia la influencia del estrés térmico y de la alteración de las proteínas estructurales de pared que el mutante presenta, lo que provoca una mayor permeabilidad de la misma, facilitando la salida al exterior de las microvesículas. Del conjunto de proteínas identificadas en la composición de los exosomas purificados, tan solo 158 (el 16,0 %) son comunes a las tres cepas crecidas a 28ºC (SC5314 y mutantes glx3 y piry consideramos que estas son fundamentales para la producción y secreción de las vesículas extracelulares, ya que en ellas se incluyen las funciones de lisis, que mediante la hidrólisis de polisacáridos y manoproteínas, permitirán remodelar la estructura de la pared, lo que facilita la salida de las microvesículas al exterior, recuperando posteriormente la integridad de la pared celular. Mecanismo que ha podido ser confirmado mediante microscopía electrónica de transmisión. Se han detectado y secuenciado 34 miRNA, 32 de los cuales son específicos de C. albicans y 2 de ellos, además, poseen total homología con humanos. Todos los miRNA están ubicados en regiones intergénicas. El análisis de las funciones de los genes flanqueantes, sobre los que podrían ejercer algún posible mecanismo de regulación de la expresión génica, pone de manifiesto que, en su mayor parte, poseen funciones de respiración y también relacionadas con la formación de biopelículas y con tRNA mitocondrial. De los dos miRNA que presentan homología completa con humanos, uno de ellos está relacionado con el aumento de la población de células madre en carcinomas de colon y un pronóstico desfavorable en los casos de cáncer gástrico, mientras que el otro, está considerado como diana molecular para prevenir el cáncer esofágico y como un posible biomarcador en el carcinoma colo-rectal. Los análisis realizados en exosomas purificados de levaduras del género Candida, indican que su génesis y secreción, requieren de la intervención de un gran número de proteínas, por lo que las microvesículas extracelulares podrían ser consideradas como una plataforma antigénica que serviría de punto de partida en la preparación de nuevas vacunas. Además, dicho mecanismo podría ser tenido en cuenta en el diseño de nuevos fármacos antifúngicos, al producirse, en el proceso de secreción, una significativa remodelación de la estructura de la pared celular de la levadura que la haría más vulnerable.A method of obtaining exosomes has been developed from yeast cultures of the genus Candida, which has allowed to obtain microvesicles of high homogeneity and purity. By means of transmission electron microscopy and nanoparticle detection techniques (NTA), it has been possible to verify the presence of microvesicles of sizes between 100 and 200 nm. The characterization of proteins carried out by Western blot techniques has revealed the high purity of the obtained exosomes and there is no cellular contamination in the preparations, as indicated by the positive result against calnexin in the cell lysate and negative In the extracellular vesicles; Positive versus enolase in the extracellular vesicles and negative in the ultracentrifugation supernatant; Positive against tetraspanins CD9, CD63 and CD81, in the microvesicles and negative in the cell lysate; Positive on Hsp70, both in microvesicles and in ultracentrifugation and positive supernatant, with high polydispersion against anti-wall antibodies, in microvesicles. Treatment with Concanavalin A-ferritin has allowed the detection of the presence of mannoproteins in isolated microvesicles. The proteomic analysis allowed to identify a high number of proteins in the exosomes of the four strains analyzed, C. albicans SC5314 at 37ºC, C. albicans SC5314 at 28ºc and the mutants glx3 and pir1, both grown at 28ºC, reaching a Total of 985. Of these, only 181 are found in the exosomes of C. albicans SC5314 at 37 ° C, increasing to 350 when growing at 28 ° C and up to 932 in the case of the mutant pir1, which shows the influence the thermal stress and the alteration of the wall structural proteins that the mutant presents, which causes a greater permeability of the same, facilitating the exit to the exterior of the microvesicles. Of the set of proteins identified in the composition of the purified exosomes, only 158 (16.0%) are common to the three strains grown at 28ºC (SC5314 and glx3 and pir1mutants) and we consider them to be fundamental for the production and secretion of the extracellular vesicles, since they include the functions of lysis, which through the hydrolysis of polysaccharides and mannoproteins, will allow remodeling of the wall structure, which facilitates the exit of the microvesicles to the exterior, recovering subsequently the integrity of the cell wall. Mechanism that has been confirmed by transmission electron microscopy. 34 miRNAs have been detected and sequenced, 32 of which are specific for C. albicans and 2 of them, in addition, have total homology with humans. All miRNAs are located in intergenic regions. The analysis of the functions of the flanking genes, on which they could exert some possible mechanism of regulation of gene expression, shows that, for the most part, they have breathing functions and also related to the formation of biofilms and with tRNA mitochondrial. Of the two miRNAs that show complete homology to humans, one of them is related to the increased population of stem cells in colon carcinomas and an unfavorable prognosis in gastric cancer cases, while the other is considered as a molecular target to prevent esophageal cancer and as a possible biomarker in colorectal carcinoma. The analyzes carried out on purified exosomes of yeasts of the genus Candida indicate that their genesis and secretion require the intervention of a large number of proteins, so the extracellular microvesicles could be considered as an antigenic platform that would serve as a starting point in The preparation of new vaccines. In addition, this mechanism could be taken into account in the design of new antifungal drugs, as a significant remodeling of the cell wall structure of the yeast in the secretion process would make it more vulnerable