Produção, caracterização, degradação e citotoxicidade de arcabouços de PLGA+HA/?TCP com sinvastatina incorporada

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2017.As perdas ósseas decorrentes de perdas dentárias ou doenças degenerativas fizeram com que houvesse interesse na busca por estratégias de regeneração óssea, a fim de repor o osso que foi perdido. Devido às suas características biológicas e mecânicas, o osso exige estratégias complexas para permitir a reconstituição da sua estrutura e função. Os principais quesitos para uma estratégia eficaz de engenharia óssea incluem um número suficiente de células formadoras de osso, um arcabouço capaz de conduzir estas células e oferecer suprimento sanguíneo adequado, e fatores de crescimento capazes de induzir a diferenciação celular. Assim, o objetivo deste estudo foi produzir arcabouços de ácido polilático co-glicólico com hidroxiapatita e ß-tricálcio fosfato (PLGA+HA/ßTCP), adicionados de sinvastatina a 5%, bem como caracterizar e avaliar a degradação e a citotoxicidade destes arcabouços, de forma a verificar se os mesmos poderiam ser promissores para aplicação clínica. Os arcabouços foram obtidos pela técnica de evaporação de solvente. Após a dissolução completa do polímero em clorofórmio, foram adicionadas partículas de sacarose e de cerâmica bifásica (hidroxiapatita (70%) e ß-TCP (30%)), na proporção 1:1 entre polímero e cerâmica. Após a evaporação do solvente, a sacarose foi removida utilizando-se álcool polivinílico. Para os arcabouços com sinvastatina incorporada, o fármaco a 5% foi diluído em clorofórmio, ao qual foram adicionados sacarose, hidroxiapatita e ß-TCP ao polímero já diluído. Os arcabouços foram seccionados em discos de 6 mm por 1 mm e esterilizados por radiação gama. Após a síntese dos arcabouços, os mesmos sofreram testes de caracterização, degradação e citotoxicidade. Para tanto, as amostras foram imersas em PBS a 37 °C, sob agitação constante, durante 1, 7, 14, 21 e 28 dias. Amostras não degradadas foram tomadas como referência. Foram realizados microscopia eletrônica de varredura, para avaliar a estrutura física; espectroscopia no infravermelho transformada por Fourier, para analisar a composição química; calorimetria exploratória diferencial, para testar as propriedades térmicas; teste da gota, para verificar a hidrofobia; e citotoxicidade, para avaliar se as amostras afetam o crescimento celular. As imagens obtidas por microscopia revelam a presença de macro, meso e microporos na estrutura do polímero, onde partículas de HA e ßTCP encontram-se bem inseridas e dispersas. Para análises químicas, observa-se um padrão bastante semelhante entre os arcabouços sem sinvastatina e com sinvastatina a 5%, com prevalência de bandas de absorção de cerca de 1750 cm-1 (C = O), e de bandas entre 350 ? 1500 cm-1 (ésteres (C ? O) ehidrocarbonetos (CH2 e CH)), assim como traços de hidrocarbonetos (CH, CH3 e CH2) por volta de 3000 cm-1. Sobre as análises térmicas, observa-se que as curvas do termograma seguem um padrão semelhante entre os arcabouços sem sinvastatina e com sinvastatina a 5%, com valores numéricos muito próximos, onde os picos endotérmicos ocorrem em cerca de 150 - 160 °C. Os arcabouços com sinvastatina mostraram-se mais hidrofílicos e mais citotóxicos que os arcabouços sem sinvastatina, chegando a uma redução de até 20% na viabilidade celular ao terceiro dia de experimento em comparação com o controle positivo. Arcabouços de PLGA+HA/ßTCP com sinvastatina a 5% apresentaram boas características físico-estruturais, químicas e térmicas, demonstrando ser um biomaterial promissor para a regeneração de tecido ósseo juntamente com células-tronco. Entretanto, quando testado sobre fibroblastos, os mesmos arcabouços mostraram-se citotóxicos na concentração de testada de sinvastatina.Abstract : Bone loss due to tooth extraction or degenerative diseases cause interest in the search for bone regeneration strategies. Due to its biological and mechanical characteristics, bone requires complex strategies to allow the reconstitution of its structure and function. The main requirements for an effective bone engineering strategy include sufficient number of bone-forming cells, scaffolds capable of conducting these cells and providing adequate blood supply, and growth factors able to induce cell differentiation. Thus, the aim of this study was to develop scaffolds of polylactic coglycolic acid, hydroxyapatite and ß-tricalcium phosphate (PLGA+HA/ß-TCP), added with 5% simvastatin, as well as to characterize and evaluate the degradation and cytotoxicity of the scaffolds in order to assess if these biomaterials could be used for further clinical proposes. The samples were obtained by the solvent evaporation technique. After complete dissolution of the polymer in chloroform, sucrose and biphasic ceramic particles (HA (70%) and ß-TCP (30%)) were added in a ratio of 1:1 between polymer and ceramic. After evaporation of the solvent, sucrose was removed using polyvinyl alcohol. For the samples with simvastatin, 5% of the medication were diluted in chloroform to which sucrose, HA and ß-TCP were added to the diluted polymer. Then, the samples were sectioned on 6 mm x 1 mm discs and sterilized by gamma radiation. After the synthesis of the scaffolds, characterization and degradation tests were conducted. For degradation, the samples were immersed in PBS at 37 °C under constant stirring for 1, 7, 14, 21, and 28 days. Non-degraded samples were taken as reference. Scanning electron microscopy was performed to evaluate the physical structure; Fourier transform infrared spectroscopy to analyze the chemical composition; differential scanning calorimetry to test the thermal properties; drop test to check for hydrophobicity; and cytotoxicity to evaluate whether the samples could affect cell growth. Microscopy images revealed the presence of macro, meso and micropores in the polymer structure, where particles of HA and ßTCP were well inserted and dispersed. On chemical analyzes, a very similar pattern is observed between the scaffolds without simvastatin and with 5% simvastatin, and a prevalence of absorption bands of about 1750 cm-1 (C = O), and bands between 350 - 1500 cm-1, characteristic of esters (C ? O) and hydrocarbons (CH2 and CH), as well as traces of CH, CH3 and CH2 hydrocarbons at about 3000 cm-1. On thermal analyzes, it was observed that the thermogram curves follow a similar pattern between the scaffolds without simvastatin and with 5% simvastatin, with very close numericalvalues, where the endothermic peaks occur at about 150 - 160 °C. Scaffolds with 5% simvastatin were more hydrophilic and cytotoxic than scaffolds without simvastatin, reaching a reduction of up to 20% in cell viability on the third day of experiment compared to the positive control. Scaffolds of PLGA+HA/ßTCP with 5% simvastatin presented good structural, chemical and thermal characteristics, revealing to be a promising biomaterial for regeneration of bone tissue along with stem cells. However, when tested on fibroblasts, the scaffolds were cytotoxic at the concentration of 5% simvastatin