Análise fenotípica e genotípica de Cryptococcus, isolados de amostras ambientais do município de Lages, Santa Catarina

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.O Cryptococcus neoformans, agente etiológico da criptococose é uma levedura encapsulada de distribuição mundial. A doença é oportunista para pacientes imunocomprometidos, mas também pode acometer indivíduos imunocompetentes. A infecção pelo fungo resulta de inalação de basidiósporos presentes no ambiente e pode causar infecção pulmonar sintomática ou assintomática autolimitada ou permanecer latente dentro de um granuloma. O fungo está classificado em três variedades: C. neoformans var grubii (sorotipo A) de distribuição mundial, C. neoformans var neoformans (sorotipo D) e C. neoformans var gattii (sorotipos B e C) e o híbrido sorotipo AD encontrados nas regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, as três variedades são reportadas como agentes etiológicos da criptococose em humanos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência do fungo Cryptococcus neoformans em amostras ambientais na Serra Catarinense e avaliar a variabilidade genética dos isolados. Excretas de pombos (720 amostras) e folhas de eucalipto (240 amostras), foram coletas no período de Abril de 2014 a Março de 2016 em intervalo de 3 meses em 18 municípios da Serra Catarinense e processadas para isolamento do fungo em meio de cultura Níger cloranfenicol a 37oC. Foram isoladas 17 amostras, todas do município de Lages e a caracterização morfológica, produção de urease, produção de melanina e quimiotipagem em meio CGB permitiram identificar presuntivamente os isolados como pertencentes ao gênero Cryptococcus. A amplificação do gene CAP59 e a restrição do fragmento amplificado com as enzimas de restrição AvaII e HaeIII permitiu identificar todos os isolados com C. neoformans var. grubii tipo A e a tipagem molecular através de PCR-fingerprinting utilizando o iniciador M13 revelou que todas as amostras pertencem ao padrão molecular VNI. Os resultados mostram que apenas C. neoformans var. grubii tipo A, padrão molecular VNI foi identificado nas amostras ambientais na Serra Catarinense.Abstract : Cryptococcus neoformans, the causative agent of cryptococcosis is an encapsulated yeast-like fungus of worldwide distribution causing a common opportunistic infection on immunocompromised patients, but also affecting immunocompetent individuals. The infection occurs via inhalation of environmental basidiospores and may lead to symptomatic or asymptomatic pulmonary disease that can be often self-limited or remain latent within a granuloma in the lung. The fungus has three varieties as follows: C. neoformans var. grubii (serotype A) worldwide distributed, C. neoformans var. neoformans (serotype D) and C. neoformans var. gattii (serotypes B and C), as well as the hybrid serotype AD are found in tropical and subtropical regions. Since human cryptococcosis in Brazil is caused by all three varieties, we have addressed in this study the occurrence and typing of C. neoformans obtained from environmental samples from the Serra Catarinense. Pigeon excreta (720 samples) and eucalyptus leaves (240 samples) were collected between April 2014 and March 2016 in a 3 months interval at the municipalities of the Serra Catarinense and processed for fungus isolation in Niger chloranphenicol medium at 37oC. A total of 17 samples were isolated from the municipality of Lages. Morphological characterization, urease and melanin production and chemotyping in CGB medium, led us to presumptively identify the isolates belonging to the genus Cryptococcus. The PCR/RFLP analysis of the CAP59 gene using HaeIII and AvaII allowed identification of the isolates as C. neoformans var. grubii type A. Molecular typing using PCR-fingerprinting with M13 primer revealed that all samples belong to NIV molecular pattern. Our results indicate the exclusive presence of C. neoformans var. grubii type A VNI in environmental samples from the Serra Catarinense