Understanding the growth of hyphae of filamentous fungi on the surfaces of solid media through computational models and confocal microscopy

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016.Abstract : This thesis was developed in the context of citrus waste biorefineries. Within such biorefineries, it has been proposed that the pectinases to be used for hydrolysis of pectin be produced by solid-state fermentation, using the filamentous fungus Aspergillus niger. During solid-state fermentation, aerial hyphae occupy the interparticle spaces, binding adjacent particles together, while surface, biofilm and penetrative hyphae secrete a pool of hydrolytic enzymes that decrease the firmness of the solid particle. The resulting morphology of the mycelium, namely the spatial distributions of these hyphae, is related to mass and heat transfer within the fermentation bed and, apparently, to the production of hydrolytic enzymes. However, more studies are necessary to understand the factors that determine the morphology of the mycelium. A useful tool for guiding such studies is a 3D phenomenological model that describes the morphology of the mycelium formed by the filamentous fungus and relates this morphology with intra- and extracellular phenomena, such as, for example, intracellular flow of substrate through the fungal network. The aim of the thesis was to provide theoretical and experimental foundations for the development of such a model. This objective was achieved in two main steps: development of a computational model for penetrative and aerial hyphae and time-lapse visualization of mycelial growth. The computational model was developed to explore the factors affecting the distribution of aerial hyphae with height above the surface and of penetrative hyphae with depth below the surface, with rules of branching and inactivation that were different for each type of hypha. These rules were adjusted to data from the literature for the growth of Rhizopus oligosporus and Aspergillus oryzae on solid media. The adjusted rules lead to the hypothesis that penetrative hypha extend mainly downwards, with their maximum length being determined by the firmness of the solid particle and the pressure drop inside the hypha. Meanwhile, aerial hyphae grow in any direction, as though their tips move in a random walk, and there is no limitation of maximum height. Aerial hyphae seem to stop extending due to steric impediments, resulting in a maximum local biomass concentration. In order to study the growth of penetrative hyphae and expression of hydrolytic enzymes, fluorescent strains of Aspergillus niger were constructed. The mode of growth of penetrative hyphae was characterized with various different inoculum density and the types of carbon sources in the medium. These results indicated that penetrative hyphae differentiate around the same time reproductive hyphae begin to grow: extension of leading hyphae is interrupted and intense branchingstarts. In addition, expression of exopolygalacturonase B in penetrative hyphae also changes with differentiation: from apical and limited to few hyphae to subapical and present in the majority of hyphae.Esta tese foi desenvolvida no contexto de biorrefinarias de polpa cítrica. Para estas biorrefinarias, propõe-se que as pectinases a serem usadas na hidrólise da pectina sejam produzidas por fermentação em estado sólido, utilizando o fungo filamentoso Aspergillus niger. Na fermentação em estado sólido, hifas aéreas ocupam o espaço entre as partículas, entrelaçando partículas adjacentes, enquanto que hifas superficiais, de biofilme e penetrantes secretam enzimas hidrolíticas que modificam a consistência das partículas. A morfologia do micélio formado, ou seja, a distribuição espacial das hifas, está relacionada com a eficiência de transferência de massa e de calor através do leito de fermentação e, aparentemente, com a produção de enzimas hidrolíticas. No entanto, faltam estudos sobre os fatores que determinam a morfologia do micélio. Uma ferramenta útil para guiar estes estudos é um modelo fenomenológico 3D que descreve a morfologia adotada pelo fungo filamentoso e relaciona esta morfologia a fenômenos intra e extracelulares, como, por exemplo, fluxo intracelular de substrato através do micélio. O objetivo desta tese foi obter fundamentação teórica e experimental para o desenvolvimento deste modelo. Para este fim, o trabalho foi conduzido em duas partes: desenvolvimento de um modelo matemático para hifas penetrantes e aéreas e visualização do crescimento do micélio em time-lapse. O modelo matemático foi desenvolvido para investigar os fatores que afetam a distribuição de hifas aéreas em função da altura acima da superfície do meio e de hifas penetrantes em função da profundidade abaixo da superfície. Neste modelo, o espaço acima e abaixo da superfície é dividido em andares e a extensão das hifas é descrita pela adição de segmentos de hifa, de tamanho fixo, em cada andar. O modelo inicia-se com pontas de hifa na superfície, a partir das quais segmentos de hifa podem estender e cada segmento formado pode continuar estendendo, ramificar ou inativar, de acordo com regras de probabilidade, que são diferentes para cada tipo de hifa. Estas regras, e os parâmetros correspondentes, foram ajustadas aos dados de distribuição de biomassa de Rhizopus oligosporus e Aspergillus oryzae, em diferentes meios sólidos. Com base nestas regras, foram propostas hipóteses de que as hifas penetrantes estendem principalmente para baixo e o comprimento máximo delas é determinado pela consistência da partícula sólida e pela perda de carga no interior da hifa. Enquanto isso, as hifas aéreas crescem em qualquer direção, como se suas pontas se movimentassem seguindo o passeio aleatório, e não há limitação de altura máxima para o crescimento. As hifas aéreas param de estender devido ao impedimento estérico,resultante de uma máxima concentração local de biomassa. A fim de investigar o crescimento de hifas penetrantes e a expressão de pectinases ao longo do micélio, duas cepas fluorescentes de Aspergillus niger foram desenvolvidas: as duas cepas expressam o gene eGFP (proteína fluorescente verde melhorada) sob um promotor constitutivo e um gene de fusão de uma poligalacturonase e mCherry, que é uma proteína fluorescente vermelha, sob o promotor nativo da poligalacturonase. A poligalacturonase escolhida para a cepa pgaRed foi a endopoligalacturonase B, codificada no gene pgaB, cujo promotor é constitutivo, ao passo que a poligalacturonase escolhida para a cepa pgxRed foi a exopoligalacturonase B, codificada no gene pgxB, cujo promotor é induzido por galacturonato presente no meio. Através destas cepas, o modo de crescimento das hifas penetrantes foi caracterizado: se a densidade de esporos é baixa, hifas penetrantes podem ser formadas diretamente do tubo germinativo, caso contrário, as hifas penetrantes são formadas apenas depois que as hifas superficiais atingirem uma densidade mínima; as ramificações são subapicais e bem distribuídas ao longo da hifa parental, exceto quando a densidade de hifas dentro do sólido é alta e, neste caso, as ramificações ocorrem nas regiões de menor densidade de hifas, que geralmente são próximas às pontas das hifas parentais. As hifas penetrantes diferenciam-se no mesmo momento em que surgem as hifas reprodutivas e, a partir deste momento, as hifas parentais param de estender e ocorre intensa formação de ramificações. Além disso, a expressão de pgxB nas hifas penetrantes muda de apical, e limitada a poucas hifas, para subapical e presente na maioria das hifas. O tipo de fonte de carbono afeta o tempo de germinação, a profundidade máxima atingida pelas hifas penetrantes e a frequência de ramificação por hifa. Por fim, o conhecimento adquirido com as cepas fluorescentes foi utilizado para delinear como o modelo fenomenológico 3D deve ser desenvolvido no futuro