Desenvolvimento e avaliação de nanopartículas magnéticas como sistemas de entrega de siRNA em linhagem celular de câncer de mama HER-2 positivo

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais diagnosticado no mundo e representa a principal causa de morte entre as mulheres. Cerca de 20% dos casos apresentam a superexpressão da proteína HER-2 o que garante pior prognóstico devido à agressividade do tumor, alto poder metastático e recidiva. Devido aos diversos mecanismos de resistência às terapias convencionais evidencia-se a necessidade de tratamentos mais efetivos. Neste contexto, a utilização do efeito de RNA de interferência (RNAi) apresenta-se como alternativa, por possibilitar o controle da produção de proteínas através da interferência sequência-específica. Devido às características da molécula de siRNA e barreiras biológicas, a utilização de sistemas nanocarreadores apresenta-se como estratégia para proteção e transporte à célula alvo. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo desenvolver, caracterizar e aplicar um novo sistema nanocarreador de siRNA para a terapia anticâncer. As IO-caf@CaP/siHER2/PEG-PAsp correspondem a um sistema formado por um núcleo magnético recoberto com ácido cafeico, sais inorgânicos, siRNA e bloco de copolímero. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) revelaram nanopartículas esféricas e as medidas por espalhamento de luz dinâmico (DLS) apresentaram diâmetro médio por intensidade de 134,70 nm e índice de polidispersão de 0,163. A formulação apresentou carga superficial igual a -3,06 e concentração de 6,49 × 1012 partículas/mL na análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). As partículas mostraram-se estáveis após 42 dias de armazena-mento e liofilização. A taxa de incorporação de siRNA variou de 87 a 99%. De acordo com estudos de citotoxicidade as nanopartículas não apresentaram toxicidade às células HCC1954 além disto aumentaram a captação celular após aplicação de campo magnético externo. Tanto a análise por microscopia confocal quanto por qRT-PCR demonstraram que as nanopartículas foram eficientes carreadores de siRNA além de serem capazes de promover o escape endossomal. Diante dos dados obtidos, as IO-caf@CaP/siHER2/PEG-PAsp apresentaram-se como sistemas promissores para a entrega de siRNA na terapia de RNAi possuindo tamanho, forma e carga superficial adequados para aplicação biomédica. Além do mais, as nanopartículas mostraram-se eficientes em carrear o siRNA à célula alvo e promover o silenciamento do gene HER-2 em linhagem celular de câncer de mama HER-2 positivo. Abstract : Breast cancer is the second most diagnosed cancer in the world and is the leading cause of death among women. Approximately 20% of cases presents overexpression of HER-2 protein, which has been associated with highly aggressive disease, increased metastatic potential, recurrence and poor survival. However, several mechanisms of resistance to conventional therapies are being described, and then new and more effective therapies are urgently needed. In this context, the interference effect by RNAi pathway presents itself as an attractive strategy to block proteins expression by sequence-specific RNA interference. Thus, this study aimed to develop, characterize and apply a new nanocarrier system for siRNA anticancer therapy. After addition of caffeic acid coating on iron oxide nanoparticles the system formed by a magnetic core coated with inorganic salts, siRNA and block copolymer, IO-caf@CaP/siHER2/PEG-PAsp, was synthesized and characterized. The transmission electron microscopy (TEM) images revealed spherical nanoparticles and the dynamic light scattering (DLS) measurements showed averaged hydrodynamic diameter in the intensity histogram of 134.70 nm and polydispersity index of 0.163. The formulation has the surface charge equal to -3.06 and concentration of 6,49 × 1012 particles/mL determined by nanoparticle tracking analysis (NTA). The particles seemed to be stable even after 42 days of storage, and after lyophilization. The siRNA incorporation rate ranged from 87 to 99%. According to the cytotoxicity by MTT studies, the IO-caf@CaP/siHER2/PEG-PAsp are not toxic to the cell line HCC1954 and the magnetic field increased their cellular uptake. Both the analysis, confocal microscopy and the qRT-PCR assay demonstrated that the nanoparticles were effective nanocarriers of siHER2 and were able to promote endosomal escape. In this context, the nanoparticles IO-caf@CaP/HER2/PEG-PAsp presented themselves as promising carrier systems for siRNA delivery, for RNA interference therapy, having size, shape and surface charge suitable for biomedical applications. Furthermore, the nanoparticles were shown to be efficient in carrying the siRNA to the target cell and promote silencing of the HER-2 gene in HER-2 positive breast cancer cell line