Genome-wide analysis of recombinant protein expression in Chinese hamster ovary cells

Chinese hamster ovary (CHO) Zellen sind derzeit die Arbeitstiere der biopharmazeutischen Industrie für die Produktion von rekombinanten therapeutischen Proteinen, hauptsächlich, weil sie dazu befähigt sind, in Suspension zu wachsen und komplexe Proteine mit human-ähnlicher Glykosylierung zu sekretieren. Obwohl CHO Zellen schon seit über 25 Jahren dafür verwendet werden, sind die zellulären Prozesse, welche die Synthese und Sekretion von rekombinanten Proteinen steuern und limitieren, noch sehr schlecht verstanden. Zudem stellen andere Expressionssysteme wie die Hefe Pichia pastoris eine interessante Alternative dar. Um die Fähigkeit von CHO Zellen und P. pastoris rekombinante Proteine zu sekretieren zu vergleichen, wurden Zelllinien bzw. Stämme entwickelt, die zwei unterschiedlich komplexe Proteine produzieren und diese in vergleichbaren Bioprozessen kultiviert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Sekretionsmaschinerie von CHO Zellen wesentlich effizienter ist. Besonders die Sekretion des komplexeren Proteins war in P. pastoris stark beeinträchtigt. Um die rekombinante Proteinproduktion in CHO Zellen auf einer physiologischen Ebene zu untersuchen und um Genexpressionsdaten für einen speziesübergreifenden Vergleich mit P. pastoris zu generieren, wurden niedrig- und hochproduzierende CHO Zelllinien sowie ein Nichtproduzent unter stationären Bedingungen kultiviert und die Gesamtgenexpression mittels eines neuen CHO-spezifischen Microarrays gemessen. Zusätzlich wurde auch die Expression von microRNAs analysiert. MicroRNAs sind kurze (22 Nukleotide) nicht-kodierende RNAs, die eine wichtige Rolle bei der Regelung der Genexpression in höheren Eukaryoten spielen. Daher wird ihnen ein großes Potential als Ziel für die gentechnische Optimierung (Cell Engineering) von CHO Zellen zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurden etliche Gene und microRNAs identifiziert, die möglicherweise an der rekombinanten Proteinproduktion in CHO Zellen beteiligt sind und daher potenzielle Ziele für Cell Engineering zur Verbesserung bioprozessrelevanter Eigenschaften, wie Produktivität und Langlebigkeit darstellen. Allerdings deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass die Reaktion von CHO Zellen auf die Expression von Fremdproteinen stark produkt- und/oder klon-spezifisch ist.Chinese hamster ovary (CHO) cells are currently the workhorses of the biopharmaceutical industry for the production of recombinant therapeutic proteins, mainly because of their ability to grow in suspension and to secrete complex proteins with human-like glycosylation. However, although CHO cells have been used for more the 25 years, the cellular processes that control and limit recombinant protein synthesis and secretion are still poorly understood. In addition, other expression systems such as the yeast Pichia pastoris are about to enter this field. To compare their capability for recombinant protein secretion, high producing CHO cell lines and P. pastoris strains expressing two proteins of different complexity were established and cultivated in comparable bioprocesses. Our results indicate that the protein secretion machinery of CHO cells is much more efficient, and especially the secretion of the more complex protein was strongly impaired in P. pastoris. To investigate recombinant protein production in CHO cells at a physiological level and to provide transcriptomics data for a cross-species comparison with P. pastoris, low and high producing CHO cell lines as well as a non-producer were cultivated under steady-state conditions and global gene expression was profiled using a novel CHO-specific microarray. In addition, the expression of microRNAs was analyzed. MicroRNAs are short (22 nucleotides) non-coding RNAs that play an important role in the regulation of gene expression in higher eukaryotes and therefore may have great potential as cell engineering targets. In the present study, we identified several genes and microRNAs that might be involved in recombinant protein production in CHO cells and consequently may constitute potential targets for cell engineering to improve bioprocess-relevant properties such as productivity or longevity. However, our results also suggest that the reaction of CHO cells to heterologous protein expression is strongly product and/or clone-specific.by Andreas Michael MaccaniAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2014OeBB(VLID)193168