Mechanisms of catalysis and inhibition of chlorite dismutase

Chlorit ist eine anthropogene, umweltverschmutzende Substanz. Das Hämenzym, Chlorit Dismutase (Cld), kann giftiges Chlorit in harmloses Chlorid sowie molekularen Sauerstoff umwandeln und katalysiert dabei eine Sauerstoff-Sauerstoff Doppelbindung. In dieser Arbeit wurden zwei repräsentative, aktive (Chlorit abbauende), bakterielle Clds biochemisch und biophysikalisch untersucht. Die beiden Clds unterscheiden sich in ihrer oligomeren Struktur, sowie in der größe ihrer Untereinheiten. Pentamere Cld von "Candidatus Nitrospira defluvii" (NdCld) hat eine sehr hohe intrinsische Stabilität (Tm=90C), während dimere Cld von Nitrobacter winogradskyi (NwCld) bereits bei niedrigeren Temperaturen schmilzt. Die Bestimmung der Redoxpotentiale verdeutlichte, dass die Umgebung des Häms und die Architektur des Substratkanals in beiden Enzymen sehr ähnlich ist. Um die Rolle von konservierten Aminosäureresten in der Nähe des aktiven Zentrums zu untersuchen wurde zielgerichtete Mutagenese angewandt. Zwölf NdCld-Varianten wurden hergestellt und kinetisch sowie spektroskopisch untersucht. Die Ergebnisse zeigen dass das distale Arginin, die einzig geladene Aminosäure auf der distalen Seite des Häms, wichtig aber nicht essentiell für die Aktivität von Clds ist. Es scheint eine untergeordnete Rolle bei der Substratbindung zu spielen, jedoch eine entscheidende, um Hypochlorit, das während der Reaktion zwischenzeitlich gebildet wird, im aktiven Zentrum zu halten. Reste an der proximalen Seite, die ein ein H-Brückenbindungsnetzwerk bilden, sind für die Integrität des Häms im Enzym wichtig. Weiters wurde gezeigt, dass Hypochlorit, das während der Reaktion zwischenzeitlich gebildet wird, für die irreversible Inaktivierung von Clds verantwortlich ist. Es kann gelegentlich das Reaktionszentrum verlassen und daraufhin das Protein und den Co-Faktor oxidativ modifizieren. Abschließend wird ein Mechanismus für den Chloritabbau durch Chloritdismutasen vorgeschlagen.Chlorite is an anthropogenic pollutant of increasing concern. The heme enzyme chlorite dismutase (Cld) is able to convert toxic chlorite into chloride and molecular oxygen by forming a covalent oxygen-oxygen bond. In this work two representative, chlorite degrading (active), bacterial chlorite dismutases with different oligomeric and subunit structure were biochemically and biophysically characterized. Pentameric Cld from the nitrite-oxidzing bacterium "Candidatus Nitrospira defluvii" (NdCld) exhibits a very high thermal and conformational stability, it melts at approximately 90C, in contrast to the dimeric Cld from Nitrobacter winogradskyi (NwCld) (Tm=58C). The standard reduction potential of NdCld and NwCld is essentially the same at -120 mV, proving that the heme cavity and substrate channel architecture is similar in both enzymes. NdCld was subject of site-directed mutagenesis, where conserved residues close to the heme were exchanged to elucidate their role within the enzyme. Produced variants were kinetically and spectroscopically investigated. Obtained data proved that the distal Arginine, the only charged amino acid on the distal side, is catalytically important, but not essential. While its role in substrate binding is negligible, data suggest that it has an important task in keeping a transiently produced intermediate hyopchlorite witin the reaction sphere to finally react with Compound I to chloride and dioxygen. Also it was shown that the H-bonding network on the proximal side of the heme is very susceptible to pertubation and is important for the correct integrity of the co-factor. Further we showed that the intermediate hypochlorite is responsible for a major part of the irreversible inactivation of the enzyme, by escaping the active site and oxidatively modifying the heme-cofactor as well as the protein matrix. In the end a mechanism of Cld-mediated chlorite degradation is proposed.Stefan HofbauerAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2014OeBB(VLID)193130