Towards generation of transplastomic plants expressing antigens against human pathogens, for use as vaccines

Um eine neue Plattform zur Impfstoff-Produktion für einkommensschwache Länder zu entwickeln, untersuchte die vorliegende Studie die Herstellung transplastomer Pflanzen zur Expression von Antigenen gegen zwei Pathogene: Human Papilloma Virus (HPV) und Mycobacterium spp. Ein modifiziertes HPV L1 Gen mit GST als Fusionsprotein wurde in Tabak-Plastiden transformiert. Die Expression dieses rekombinanten Proteins wurde mittels Antigen Capture ELISA gezeigt, indem konformationsspezifische Antikörper am GST-L1 Fusionsprotein binden. Dieser Assay bestätigte dessen korrektes Assembly, die Voraussetzung einer positiven Immunreaktion. In einer Southern Blot Analyse wurde untersucht, ob die Pflanzen komplett transformiert sind. Dieser Test bestätigte die Homoplasmie der Transformanten in allen Generationen: T0-T3. Die zweite Transformation erfolgte mit einem Vektor, welcher das mmpI Gen beinhaltet. Dieses codiert ein 35kDa Protein, welches gegen Mycobacterium spp immunisiert. Die Pflanzen wurden mittels PCR positiv getestet; allerdings erreichten die Transformanten nicht ihr homoplastomes Stadium. Daher ist anzunehmen, dass MMPI einen Gegenselektionsdruck gegen transformierte Pflanzenzellen aufbaut. Um derartige Probleme gegen-selektiver Transgene zu lösen, kommt in Betracht, solche Transgene erst nach der sensitiven Regenerationsphase zu exprimieren: Zu diesem Zweck wurde ein Induktionssystem getestet, das die Regulation der Expression zu einem gewählten Zeitpunkt erlaubt. Diese Alternative wurde mittels Expression des GUS Gens analysiert. Dieses stand unter Kontrolle des Promoters für eine kern-kodierte, chloroplasten-importierte, ethanol-induzierbare T7 RNA Polymerase. Zwei Tests bestätigten die ethanol-induzierbare GUS-Expression. Dieses Ergebnis zeigte, daß das induzierbare System zur regulierbaren Expression des mmpI Gens genutzt werden könnte. Zusammengenommen tragen diese Ergebnisse einen weiteren Schritt dazu bei, kosten-effiziente Impfstoffe zu produzieren.To develop a new platform for vaccine production for low-income countries, the current study has investigated the generation of transplastomic plants expressing antigens against two pathogens: Human Papilloma virus (HPV) and Mycobacterium leprae. A modified HPV L1 gene with GST as a fusion protein was transformed into tobacco plastids. Expression of this recombinant protein was shown with an antigen capture ELISA by binding of conformation-specific antibodies. Assay confirmed correct assembly of the GST-L1 fusion protein which is necessary for positive immune reaction in future use. Southern Blot analysis confirmed homoplasmy of all transformants in all three generations T0-T3. The second transformation was performed with a vector covering the mmpI gene encoding a 35kDa protein which confers cross-protection against leprosy and Mycobacterium avium. The plant material was tested by PCR positively; however, the transformants did not reach homoplasmic state. One explanation for heteroplasmy could be a putative detrimental effect of constitutive expression of mmpI which might counter-select against transformed plant cells. To solve this problem a chemical induction system was tested which allows regulation of transgene expression according to a time schedule. This alternative was analyzed by expression of the GUS reporter gene under control of the promoter for a nuclear-encoded, chloroplast imported, ethanol-inducible T7 RNA polymerase in transplastomic plants. The MUG test confirmed inducible protein expression after application of 0.5% ethanol onto transformed plants. This result indicates the trans-activation system can later be used for the regulated expression of mmpI. Taken together, this data contribute another step forward towards the development of chloroplast-derived antigen expression to produce cost-efficient and easily available vaccines in low-income countries.by Syed Waqas HassanAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2011OeBB(VLID)193045