Effetto di oli essenziali sulla produzione di biofilm in Pseudomonas fluorescens di origine casearia

RIASSUNTO Il biofilm batterico è costituito da una matrice formata da sostanze extracellulari che ingloba la comunità batterica che l’ha formata, fungendo sia da protezione che da nutrimento. Tali strutture, oltre a sviluppare su matrici organiche, sviluppano anche su superfici abiotiche come plastiche o acciaio. I materiali in questione sono tra quelli più usati negli impianti e nelle attrezzature delle industrie alimentari. L’eliminazione del biofilm è una necessità per l’industria alimentare, in quanto i batteri che possono svilupparvi possono appartenere sia a specie alteranti che patogene. Negli ultimi anni la ricerca si è focalizzata sullo sviluppo di sempre nuove modalità di inibizione della formazione o di rimozione dei biofilm microbici. Gli oli essenziali (OE) rappresentano in questo ambito una possibile risposta alternativa alle modalità chimiche e fisiche di lotta contro il biofilm ed ultimamente la loro azione è stata ampiamente studiata, in particolare, al fine di sostituire i disinfettanti chimici convenzionali con sostanze naturali che hanno senz’altro un minore impatto sulla salute e l’ambiente. Gli OE sono infatti estratti ottenuti da organismi vegetali che possiedono delle componenti ad attività antimicrobica ed antibiofilm. Il lavoro di tesi è stato incentrato sulla valutazione dell’azione inibente sulla produzione di biofilm di Pseudomonas fluorescens di origine casearia, specie nota per la sua importante azione alterante sui prodotti, operata da quattro diversi OE utilizzati a concentrazioni sub-inibenti: timo bianco (Thymus vulgaris), manuka (Leptospermum scoparium), bergamotto (Citrus bergamia) e cannella (Cinnamomum zeylanicum). Allo scopo sono stati utilizzati 9 Pseudomonas fluorescens isolati da mozzarelle del commercio con difetti di pigmentazione anomala, oltre ad un ceppo di referenza ATCC. Su di essi è stata preliminarmente determinata la capacità di produrre biofilm su piastre di polistirene. Per stabilire la concentrazione sub-inibente degli OE, è stata preventivamente determinata la minima concentrazione inibente (MIC) di ciascun OE nei confronti degli isolati in esame con metodo di microdiluizione su piastra. Successivamente sui batteri sviluppati in presenza di una concentrazione di MIC/2 dei singoli OE è stata valutata la riduzione della produzione di biofilm in rapporto alla produzione degli stessi batteri non trattati. I risultati hanno evidenziato per gli isolati in esame, tutti medi o forti produttori di biofilm, valori di MIC molto diversi per i diversi OE testati: la maggiore sensibilità è stata espressa nei confronti del timo, la minore verso manuka e bergamotto. Gli isolati hanno inoltre dimostrato una notevole variabilità di comportamento riguardo all’azione inibente esercitata dagli OE sulla produzione di biofilm. Una percentuale di riduzione di sviluppo superiore al 50% è stata riscontrata in particolare in 4 su 10 degli Pseudomonas fluorescens in esame nel caso di utilizzo di OE di timo, che è risultato quindi il migliore, anche in relazione ai favorevoli valori di MIC. ABSTRACT Bacterial biofilm is a self-produced matrix of extracellular polymeric substances that absorbs the bacterial communities and protect them. These microbial structures can develop both on organic substances and on abiotic surfaces, such as plastic or stainless steel, that are among the most used materials in the food industry. Biofilm eradication is crucial for the food industry, because within the microbial biofilm both spoilage and pathogenic species can survive. Among the different tools proposed to eradicate microbial biofilms, essential oils (EO) can represent an efficient and alternative way, particularly aimed to replace the conventional chemical disinfectants with natural substances showing a minor impact on human health and environment. EO are vegetal extracts that possess components with different antimicrobial and antibiofilm activity. This thesis work has focused on evaluating the inhibiting action on biofilm production of spoiling Pseudomonas fluorescens of dairy origin, a spoiling species very important for these products, by four EO used at sub-inhibitory concentrations: thyme (Thymus vulgaris), manuka (Leptospermum scoparium), bergamot (Citrus bergamia) and cinnamon (Cinnamomum zeylanicum). Nine Pseudomonas fluorescens, isolated from commercial mozzarella with pigmentation defects, and a reference ATCC strain were examined, by preliminary evaluation of their biofilm production on polystirene plates. Then, the minimal inhibitory concentration (MIC) of each EO on the tested bacterial isolates was determined by a microdilution method and, subsequently, the reduction of biofilm production of the isolates submitted to a MIC/2 concentration of each EO in comparison with the untreated controls was evaluated. On the basis of the results obtained, the tested isolates, which resulted intermediate or strong biofilm-producers, showed a wide variability with regard to the MIC values of the four EO: thyme evidenced the highest antimicrobial activity, while bergamot and manuka the lowest. With regard to the antibiofilm activity, the different isolates resulted differently inhibited by the same EO. A reduction percentage higher than 50% was registered in 4 of the 10 tested Pseudomonas fluorescens in presence of a MIC/2 concentration of thyme EO; thus, this EO resulted the best in the tested conditions, also considering the favourable values of MIC