Novel cationic lipoplexes in gene delivery

Gene therapy is the therapeutic delivery of nucleic acid sequences into cells, where they can replace a gene that is missing, mutated or poorly expressed. It is a potential treatment to cure e.g. genetic diseases, viral infections and various cancers. The nucleic acid needs to be delivered across the cell membrane and into the nucleus to affect the gene expression. Anionic nucleic acids need a cationic carrier, such as a cationic liposome, to enable their delivery into the cells. The liposomes used in gene delivery usually contain both a cationic lipid to associate with the nucleic acid and a neutral helper lipid to stabilize the structure. The liposome-nucleic acid complex is called a lipoplex. The cationic carrier must include or function as a cell-penetrating enhancer (CPE) to be able to translocate across the cell membrane into the cytosol and to the nucleus. The experimental part of this work was aimed at developing and characterizing an innovative poly-cationic liposomal platform for gene delivery, using a novel synthetic CPE. The CPE used in this study is an oligo-guanidyl derivative (OGD) that had either 4 (OGD4) or 6 (OGD6) cationic charges. Liposomes were surface-engineered with OGD, obtaining a cationic formulation that was then exploited for DNA loading. The study has two main characterization steps: Step 1 was to decorate liposomes with OGD by post insertion using increasing amounts of OGD, and determine the vesicle size and zeta potential by dynamic light scattering (DLS). Step 2 involved DNA loading by post insertion into the cationic liposomes with increasing amounts of DNA. The lipoplex size and zeta potential was determined by DLS, the complexation by electrophoresis, and the thermodynamics of the cationic liposome/DNA association by isothermal titration calorimetry (ITC). The measurements were performed in isotonic buffers (HEPES pH 7.4 and citrate pH 5) and in lower ionic strength TRIS buffer (pH 7.4). The aim of the characterization studies was first to find a liposome composition that includes just enough OGD to obtain a sufficiently high zeta potential and a uniform, sufficiently small size. The optimal formulation contained either 10 % of OGD4 or 5 % of OGD6 of the total lipid amount. The second step was to find the highest stable DNA loading for the lipoplexes. All the characterization studies were performed on OGD4 lipoplexes in TRIS buffer. The optimal OGD4/DNA N/P (nitrogenous/phosphorous) ratio was found to be around 5. Further investigation is needed to determine the best lipoplex composition and manufacturing method using an isotonic buffer. A DNA release study remains to be performed prior to further in vitro and in vivo studies.Geeniterapia on nukleiinihappojen annostelua kohdesoluihin, joissa ne korvaavat puuttuvan, vaurioituneen tai heikosti ilmentyvän geenin. Geeniterapia voisi tulevaisuudessa toimia vaikeiden sairauksien, kuten geneettisten sairauksien, virusinfektioiden tai useiden syöpien, hoitomuotona. Nukleiinihapon tulee läpäistä solukalvo ja päästä tumaan vaikuttaakseen geenien ilmentymiseen. Negatiivisesti varautuneet nukleiinihapot tarvitsevat positiivisesti varautuneen kantajan, kuten kationisen liposomin, päästäkseen solujen sisään. Geenien annostelussa käytetyt liposomit sisältävät yleensä kationisen lipidin, johon nukleiinihappo kiinnittyy, ja neutraalin apulipidin stabiloimaan rakennetta. Liposomi-nukleiinihappokompleksia kutsutaan lipopleksiksi. Kationisen kantajan tulisi sisältää tai toimia lisäksi soluun pääsyn edistäjänä (cell-penetrating enhancer, CPE), joka auttaa nukleiinihappoa siirtymään solukalvon läpi ja edelleen tumaan. Työn kokeellisessa osuudessa kehitettiin ja tutkittiin uutta polykationista liposomialustaa geenien annosteluun, käyttäen uutta synteettistä CPE:tä. Tässä tutkimuksessa käytetty CPE on oligo-guanidyylijohdannainen (OGD), jolla on joko 4 (OGD4) tai 6 (OGD6) kationista varausta. Liittämällä liposomiin OGD:tä saatiin positiivisesti varautunut formulaatio, joka sitten lastattiin DNA:lla. Karakterisointi sisälsi kaksi vaihetta. 1. vaihe oli OGD:n liittäminen valmiisiin liposomirakkuloihin kasvavina määrinä ja rakkulan koon sekä zetapotentiaalin määritys dynaamisella valosirontamenetelmällä (DLS:llä). 2. vaihe sisälsi DNA:n lastaamisen kationiseen liposomiin kasvavina määrinä. Lipopleksin koko ja zetapotentiaali määritettiin DLS:llä, kompleksoituminen elektroforeesilla ja sitoutumisen termodynamiikka isotermaalisella titraatiokalorimetrialla (ITC:llä). Mittauksia tehtiin sekä isotonisilla puskureilla (HEPES pH 7.4 ja sitraatti pH 5) että pienemmän ionivahvuuden TRIS-puskurilla (pH 7.4). Karakterisoinnin tavoitteena oli löytää liposomiformulaatio, jossa pienimmällä mahdollisella määrällä OGD:tä saatiin riittävän korkea zetapotentiaali sekä riittävän pieni ja tasainen partikkelikoko. Optimaalinen formulaatio sisälsi joko 10 % OGD4:ä tai 5 % OGD6:a kokonaisliposomien määrästä. Toisena tavoitteena oli selvittää, kuinka suuri määrä DNA:ta kompleksoituu kationiseen liposomiin. OGD4-lipoplekseille TRIS-puskurissa tehtiin kaikki analyysit. OGD4:n ja DNA:n optimaaliseksi N/P (typpi/fosfori) suhteeksi saatiin noin 5. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään paras lipopleksien valmistusmenetelmä ja koostumus isotonisessa puskuriliuoksessa. Lisäksi DNA:n vapautumiskokeet pitää tehdä ennen in vitro- ja in vivo-lisätutkimuksia