Sydänlihassolujen hypertrofia lääkevaikutuksen kohteena

Left ventricular hypertrophy (LVH) is defined as an increase in left ventricular mass. It is initially a coping mechanism by which the heart tries to compensate for the increase in load caused by, for example, hypertension, but it will eventually lead to heart failure. LVH is the result of primarily an increase in cardiac myocyte size, in addition to increased apoptosis and necrosis of cardiac myocytes and fibrosis. Current treatment of LVH is based on a treatment of suspected cause, generally hypertension. Antihypertensive medication has been found to have beneficial effects on LVH. However, antihypertensive drugs can not cure LVH completely, hence other treatment options are needed. To identify new possible drug targets, it is important to increase the inadequate knowledge of the mechanisms and signal transduction pathways mediating LVH. The most relevant stimuli causing hypertrophy are considered to be mechanical stretch, as well as some humoral mediators such as angiotensin II and endothelin 1 (ET-1), to which cardiomyocytes respond through activation of several intracellular signal transduction pathways. As a result, cardiomyocyte gene expression and protein synthesis increase and sarcomeres grow and rearrange, resulting in an increase in cell size. In addition, regulation of calcium, contractile function and energy metabolism of cardiac myocytes change. Numerous intracellular signal mediators interact with each other and can compensate for each other, making it difficult to investigate the significance of individual factors. As important signal mediators are considered to include protein kinase C (PKC) and cardiac transcription factors GATA4 and NKX2-5. In vitro studies of cardiac hypertrophy are usually performed with primary cardiac myocytes isolated from the ventricles of neonatal rats. The H9c2 continuous cell line has been used in some studies as an alternative cell model to reduce the use of laboratory animals. In the experimental part of this thesis, the suitability of H9c2 cells for hypertrophy studies was examined by comparing them to primary cardiac myocytes. In addition, experimental compounds targeted to cardiac transcription factors and PKC were studied by exploring their effects on viability and hypertrophic responses of H9c2 cells and primary cardiac myocytes. The toxicity of the compounds and the effects on cell viability were studied using the lactate dehydrogenase (LDH) assay and the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The hypertrophy responses to cyclic mechanical stretch and ET-1 were primarily assessed by measuring the surface area of cells from fluorescence microscopy images. In addition, the relative expression levels of Nppa and Nppb genes in ET-1 stimulated primary cardiac myocytes were studied by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Both stretching and ET-1 caused an increase in the cell surface area in primary cardiac myocytes but not in H9c2 cells. On this basis, the H9c2 cells respond differently to hypertrophic stimuli than primary cardiac myocytes, and the suitability of H9c2 cell line to hypertrophy studies can therefore be questioned. The compounds targeted to cardiac transcription factors were not cytotoxic at 1-30 µM concentrations, but they also had no significant effect on the hypertrophic responses. In contrast, the PKC compound HMI-1a3 at 30 µM was toxic to primary cardiac myocytes and HMI-1b11 at 30 µM was toxic to H9c2 cells. HMI-1b11 and bryostatin-1 also induced changes in the hypertrophic responses of primary cardiac myocytes, but the significance of these results requires further investigation.Sydämen vasemman kammion hypertrofia (engl. left ventricular hypertrophy, LVH) tarkoittaa vasemman kammion massan kasvua. Se on alun perin sopeutumiskeino, jolla sydän yrittää kompensoida siihen kohdistuvaa esimerkiksi kohonneen verenpaineen aiheuttamaa lisääntynyttä kuormitusta, mutta se johtaa lopulta sydämen vajaatoimintaan. LVH on seurausta sydänlihassolujen eli kardiomyosyyttien koon kasvusta, minkä lisäksi niiden apoptoosi ja nekroosi sekä sydämen fibroosi lisääntyvät. Nykyinen LVH:n hoito perustuu epäillyn syyn, yleensä kohonneen verenpaineen, hoitoon. Verenpainelääkkeillä on havaittu suotuisia vaikutuksia LVH:aan, mutta niillä ei ole voitu estää hypertrofiaa täysin, joten muitakin hoitovaihtoehtoja kaivataan. LVH:n puutteellisesti tunnettujen syntymekanismien ja signaalinvälitysreittien selvittäminen on tärkeää uusien mahdollisten lääkevaikutuskohteiden löytämiseksi. Keskeisimpinä hypertrofiaa aiheuttavina ärsykkeinä pidetään mekaanista venytystä sekä joitakin humoraalisia välittäjäaineita, kuten angiotensiini II:ta ja endoteliini-1:tä (ET-1), joihin kardiomyosyytit reagoivat aktivoimalla useita solunsisäisiä signaalinvälitysreittejä. Tämän seurauksena kardiomyosyyttien geeniekspressio ja proteiinisynteesi lisääntyvät ja sarkomeerit kasvavat ja järjestäytyvät uudelleen, mikä johtaa solujen koon kasvuun. Lisäksi sydänlihassolujen kalsiumin säätely, supistustoiminta ja energia-aineenvaihdunta muuttuvat. Lukuisat solunsisäiset signaalinvälittäjät vuorovaikuttavat keskenään sekä voivat kompensoida toisiaan, mikä vaikeuttaa eri tekijöiden merkitysten tutkimista. Tärkeinä signaalinvälittäjinä pidetään muun muassa proteiinikinaasi C:tä (PKC) sekä sydämen transkriptiotekijöitä GATA4:ää ja NKX2-5:tä. Sydämen hypertrofian in vitro -tutkimuksia tehdään yleensä vastasyntyneen rotan sydämestä eristetyillä primäärisydänlihassoluilla. Vaihtoehtoisena menetelmänä on joissakin tutkimuksissa käytetty jatkuvaa H9c2-solulinjaa, minkä avulla on pyritty vähentämään koe-eläinten käyttöä. Tämän pro gradu -tutkielman kokeellisessa osassa tutkittiin H9c2-solujen soveltuvuutta hypertrofiatutkimuksiin vertaamalla niitä primäärisydänlihassoluihin. Lisäksi tutkittiin uusien kokeellisten PKC:hen ja sydämen transkriptiotekijöihin vaikuttavien yhdisteiden vaikutuksia H9c2-solujen ja primäärisydänlihassolujen elinkykyyn ja hypertrofiavasteisiin. Yhdisteiden toksisuutta ja vaikutusta solujen elinkykyyn tutkittiin laktaattidehydrogenaasitestillä (LDH-testi) ja 3-(4,5-dimetyyli-2-tiatsolyyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi-testillä (MTT-testi). Mekaanisen syklisen venytyksen ja ET-1:n aiheuttamia hypertrofiavasteita arvioitiin ensisijaisesti solujen pinta-alan määrityksellä fluoresenssivärjätyistä soluista. Lisäksi ET-1-stimuloitujen primäärisydänlihassolujen hypertrofiaan liitettyjen Nppa- ja Nppb-geenien ekspressiota mitattiin kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (engl. quantitative polymerase chain reaction, qPCR). Sekä venytys että ET-1 aiheuttivat primäärisydänlihassoluissa pinta-alan kasvun, jota ei havaittu H9c2-soluissa. Tämän perusteella H9c2-solujen vaste hypertrofiaa aiheuttaviin stimulaatioihin ei vastaa primäärikardiomyosyyteillä saatavaa vastetta ja solulinjan soveltuvuutta hypertrofiatutkimukseen voidaan siksi pitää kyseenalaisena. Tutkitut transkriptiotekijöihin vaikuttavat yhdisteet eivät 1-30 µM pitoisuuksilla olleet juuri sytotoksisia, mutta niillä ei myöskään havaittu merkittävää vaikutusta hypertrofiavasteisiin. Sen sijaan PKC:hen vaikuttavista yhdisteistä 30 µM HMI-1a3 oli toksinen primäärikardiomyosyyteille ja 30 µM HMI-1b11 H9c2-soluille. HMI-1b11 ja bryostatiini-1 aiheuttivat myös muutoksia primäärisydänlihassolujen hypertrofiavasteisiin, mutta tulosten merkityksen selvittäminen vaatii vielä lisää tutkimuksia