HPAEC-PAD-menetelmän kehitys, validointi ja käyttöönotto laktoosipitoisuuden määrittämiseksi elintarvikkeesta

Tämän maisterin tutkielman kirjallisuusosan tavoitteena oli perehtyä laktoosin kemiallisiin ja ravitsemuksellisiin ominaisuuksiin, sen esiintymiseen elintarvikkeissa ja sen määrittämiseen käytettyihin menetelmiin. Kokeellisen tutkimuksen tavoitteena oli kehittää, validoida ja ottaa käyttöön herkkä ja luotettava korkean suorituskyvyn anioninvaihtokromatografian ja pulssiamperometrisen detektion yhdistävä menetelmä (HPAEC-PAD) laktoosittomuuden varmistamiseksi ja pienten laktoosipitoisuuksien määrittämiseksi ainesosiltaan ja koostumuksiltaan erilaisista elintarvikkeista. Työ tehtiin MetropoliLab Oy:lle, jolla ei toistaiseksi ollut käytössään tarkoitukseen soveltuvaa menetelmää, mutta kasvaneen kysynnän vuoksi sellainen haluttiin kehittää. Validointimatriiseina käytettiin elintarvikkeita, joiden tiedettiin sisältävän pieniä määriä jäännöslaktoosia: rasvatonta sekä 3 % rasvaa sisältävää maitojuomaa, banaanijogurttia ja raejuustoa. Laktoosi uutettiin veteen homogenoidusta näytteestä. Näytteen proteiinit saostettiin uutteesta Carrez-reagensseilla, ja uutteen puhdistusta jatkettiin kiinteäfaasiuutolla ja suodattamalla. Laktoosin erottamiseen käytettiin vahvaa anioninvaihtokolonnia ja detektointiin pulssiamperometristä kultaelektrodilla varustettua ilmaisinta. Haasteena oli näytteiden detektointia haittaavien yhdisteiden poistaminen ja laktoosin erottaminen muista kultaelektrodilla hapettuvista yhdisteistä. Kehitetyllä näytteenkäsittelyllä sekä liuotingradientilla saavutettiin laktoosin hyvä erottuminen. Menetelmä todettiin hyvin herkäksi ja selektiiviseksi, ja koko mittausalue pitoisuuteen 40 mg/100 g asti oli lineaarinen. Menetelmän toistettavuus, uusittavuus ja tulosten oikeellisuus todettiin hyviksi. Menetelmän laajennettu mittausepävarmuus oli matriisista riippuen 11—22 %. Kehitetty menetelmä validoitiin suunnitelluille matriiseille onnistuneesti ja sen validointi muille elintarvikematriiseille aloitettiin heti. Menetelmällä voidaan luotettavasti varmistaa laktoosittomuus maitotuotteista, ja kokoon on saatu viitteitä sen hyvästä soveltuvuudesta myös liha- ja leipomotuotteille sekä valmisruoille. Suuria näytemääriä analysoitaessa menetelmä on yksinkertaisesta näytteenkäsittelystä huolimatta kokonaisuudessaan aikaavievä, ja mahdollisuuksia sen nopeuttamiseksi täytyy tutkia.The literature review of this master’s thesis dealt with the chemical and nutritional properties of lactose, lactose content in food and methods used for lactose determining. The aim of the experimental part of this thesis was to develop, validate and implement a sensitive and reliable method for determining residual lactose in different kinds of foods using high-performance anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). The method was developed for MetropoliLab in response to an increased demand. The matrices chosen for validation were food products that were known to contain traces of lactose: lactose-free skimmed milk, whole milk, banana flavoured yoghurt and cottage cheese. Lactose was extracted in water from a homogenized sample. Proteins were precipitated with Carrez-reagents and the extract was then purified by solid phase extraction and filtration. A strong anion exchange column with quaternary ammonium ion groups was used to separate lactose from other compounds found in the foods and a pulsed amperometric detector equipped with a gold electrode was used for the detection of lactose. The biggest challenges were to remove all compounds interfering with the detection of lactose and to separate lactose from other compounds oxidized at the gold electrode. The sample preparation and the solvent gradient used showed good resolution for lactose. The method was found very sensitive and selective and the whole range of measurement up to 40 mg/100 g was linear. Repeatability, reproducibility and accuracy of results were good. The measurement uncertainty of the method was 11—22 %, depending on the sample matrix. The method development and validation were completed successfully using different kinds of dairy products as sample matrices. Validation for other food matrices was started immediately and the experiments have already shown some promising results indicating the method’s suitability for meat, bakery and convenience food products. In spite of the simple sample preparation step the method is time consuming when analysing large sample arrays and options to overcome it are necessary to examine