Growth temperature variation and heat stress response of Clostridium botulinum

Clostridium botulinum, the causative agent of botulism in humans and animals, is frequently exposed to stressful environments during its growth in food or colonization of a host body. The wide genetic diversity of the strains of this foodborne pathogen has been thoroughly studied using different molecular biological methods; however, it is still largely unknown how this diversity reflects in the ability of different C. botulinum strains to tolerate environmental stresses. In contrast to cold tolerance, which has been the focus of intensive research in recent years, the molecular mechanisms C. botulinum utilizes in response to heat shock and during adaptation to high temperature stress are poorly understood. The aims of this study were to investigate the strain variation of Group I and II C. botulinum with regard to growth at low, high, and optimal temperature; the roles of hrcA, the negative regulator of Class I heat shock genes (HSG) and dnaK, a molecular chaperone coding Class I HSG, in the response of the Group I C. botulinum strain ATCC 3502 to heat and other environmental stresses; and the molecular mechanisms this strain employs in response to acute and prolonged heat stress. The maximum and minimum growth temperatures of 23 Group I and 24 Group II C. botulinum strains were studied. Further, maximum growth rates of the Group I strains at 20, 37, and 42°C and of the Group II strains at 10, 30, 37, and 42°C were determined. Within their groups, the C. botulinum strains showed significant variation in growth-limiting temperatures and their capability to grow at extreme temperature, especially at high temperature. Largest strain variation was found for Group I within type B and for Group II within type E strains, which further showed more mesophilic growth tendencies than the other Group II strains. However, the genetic background of the selected C. botulinum strains reflected only weakly in their growth characteristics. Group I strains showed larger physiological variation despite being genetically more closely related than Group II. A number of strains of both groups showed faster growth at temperatures above than at their commonly assumed optimal growth temperatures of 30°C for Group II and 37°C for Group I strains. In addition, they possessed higher maximum growth temperatures than the average of the studied strains. These strains can be expected to have higher than assumed optimal growth temperatures and pronounced high temperature stress tolerance. Good correlation was detected between maximum growth temperatures and growth rates at high temperature, although not for all strains. Therefore direct prediction from one studied growth trait to the other was impossible. These findings need to be taken into account when estimating the safety of food products with regard to C. botulinum by risk assessment and challenge studies. The role of Class I HSGs in C. botulinum Group I strain ATCC 3502 was studied by quantitative real-time reverse transcription PCR and insertional inactivation of the Class I HSGs hrcA and dnaK. During exponential and transitional growth, Class I HSGs were constantly expressed followed by down-regulation in the stationary phase. Exposure of mid-exponentially growing culture to heat shock led to strong, transient Class I HSG up-regulation. Inactivation of hrcA resulted in over-expression of all Class I HSGs, which confirmed its role as negative regulator of Class I HSGs in C. botulinum. Both inactivation mutants showed impaired high temperature tolerance as indicated by reduced growth rates at 45°C, a reduced maximum growth temperature, and increased log-reduction after exposure to lethal temperature. The growth of the dnaK mutant was more strongly affected than that of the hrcA mutant, emphasizing the importance of the molecular chaperone DnaK for C. botulinum. Reduced growth rates were evident for both mutants under optimal conditions and heat stress, but also under low pH, and high saline concentration. This suggests a probable role for Class I HSG in cross protection of C. botulinum against other environmental stresses. C. botulinum ATCC 3502 was grown in continuous culture and exposed to heat shock followed by prolonged high temperature stress at 45°C. Changes in the global gene expression pattern induced by heat stress were investigated using DNA microarray hybridization. Class I and III HSGs, as well as members of the SOS regulon, were employed in response to acute heat stress. High temperature led to suppression of the botulinum neurotoxin coding botA and the associated non-toxic protein-coding genes. During adaptation and in the heat-adapted culture, motility- and chemotaxis-related genes were found to be up-regulated, whereas sporulation related genes were suppressed. Thus, increase in motility appeared to be the long-term high-temperature stress-response mechanism preferred to sporulation. Prophage genes, including regulatory genes, were activated by high temperature and might therefore contribute to the high temperature tolerance of C. botulinum strain ATCC 3502. Further, remodeling of parts of the protein metabolism and changes in carbohydrate metabolism were observed.Clostridium botulinum on vakavan taudin aiheuttaja sekä ihmisille että eläimille. Sen kasvuun vaikuttavat useat tekijät elintarvikkeiden valmistuksen ja säilytyksen aikana. Tämän elintarvikkeiden välityksellä leviävän taudinaiheuttajan laajaa geneettistä monimuotoisuutta on tutkittu monilla molekyylibiologisilla menetelmillä. Silti ei vielä suurelta osin tiedetä, miten tämä monimuotoisuus vaikuttaa C. botulinum -kannoilla ympäristön aiheuttaman stressin sietokykyyn. Verrattuna kylmänsietokykyyn, jota tutkimusryhmämme on laajasti tutkinut viime vuosina, tiedetään hyvin vähän siitä, miten C. botulinumin käyttämät molekyylitason mekanismit reagoivat lämpösokkiin sekä sopeutuvat korkean lämpötilan aiheuttamaan stressiin. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ryhmien I ja II C.botulinum -kantojen välisiä kasvueroja alhaisessa, korkeassa sekä optimaalisessa lämpötilassa. Luokan I lämpösokkigeenien ilmentymiseen vaikuttavien geenien hrcA (lämpösokkigeenien negatiivinen säätelijä) sekä dnaK (lämpösokkigeeni, joka osallistuu solun sokkivasteessa tuottaman kaitsijaproteiinin koodaamiseen) rooleja tutkittiin ryhmän I C.botulinum -kannan ATCC 3502 vasteessa lämpöön ja muuhun ympäristön aiheuttamaan stressiin. Lisäksi selvitettiin molekyylitason mekanismeja joita kyseinen kanta käyttää altistuessaan äkilliselle ja pitkittyneelle lämpöstressille. Tutkimuksessa tarkasteltiin 23 ryhmän I ja 24 ryhmän II C. botulinum -kantaa. Niiden maksimi- ja minimikasvulämpötilat määritettiin sekä tarkasteltiin kasvunopeuksia eri lämpötiloissa. Ryhmien sisällä havaittiin merkittävää vaihtelua kasvua rajoittavissa lämpötiloissa sekä kyvyssä kasvaa äärimmäisissä lämpötiloissa, erityisesti korkeassa lämpötilassa. Ryhmän I kantojen välillä ilmeni suurempaa fysiologista vaihtelua huolimatta siitä, että ne ovat geneettisesti läheisempiä keskenään kuin ryhmän II kannat. Useat tutkituista ryhmien I ja II kannoista kasvoivat nopeammin yleisesti oletettua optimaalista kasvulämpötilaa korkeammissa lämpötiloissa. Lisäksi näiden kantojen maksimikasvulämpötila oli keskimääräistä korkeampi kuin muilla tutkituilla kannoilla. Voidaan olettaa, että näillä C. botulinum -kannoilla on merkittävä lämpöstressinsietokyky, sekä niiden todellinen maksimikasvulämpötila on korkeampi kuin on tähän mennessä luultu. Kantojen väliset fysiologiset vaihtelut tulee ottaa huomioon elintarvikkeiden turvallisuutta ja C. botulinum -riskiä arvioitaessa. Lämpösokkigeenien roolia ryhmän I C. botulinum ATCC 3502 -kannalla tutkittiin kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla sekä inaktivoimalla bakteerin genomista lämpösokkigeenit hrcA ja dnaK. Lämpösokkigeenit olivat aktiivisina nopeasti lisääntyvän kasvun aikana kunnes niiden ilmentyminen hiljeni kasvun tasaannuttua. Kun nopean kasvun vaiheessa oleva bakteerikasvusto altistettiin lämpösokille, havaittiin lämpösokkigeenien voimakas, mutta lyhytaikainen ilmentyminen. C. botulinumilla hrcA -geenin toimimattomuus lisäsi merkittävästi muiden luokan I lämpösokkigeenien aktiivisuutta, vahvistaen näin kyseisen geenin roolia lämpösokkigeenien negatiivisena säätelijänä. Sekä hrcA- että dnaK geenien toiminnan hiljentäminen heikensi tutkitun kannan lämmönsietokykyä selvästi, mikä näkyi hidastuneena kasvuna 45 °C:ssa, alentuneena maksimikasvulämpötilana, sekä korkeassa lämpötilassa nopeutuneena solujen tuhoutumisena. dnaK -geenin toimimattomuus heikensi kasvua voimakkaasti viitaten kyseisen geenin koodaaman kaitsijaproteiinin keskeiseen rooliin C. botulinum -bakteerilla. Geenien toiminnan inaktivoinnin todettiin lisäksi alentavan kasvunopeutta happamassa ympäristössä sekä korkeassa suolapitoisuudessa. Havainto antaa viitteitä lämpösokkigeenien mahdollisesta roolista myös muissa kuin lämpötilaan liittyvissä ympäristöstresseissä. C. botulinum ATCC 3502 -kannan jatkuvassa kasvatuksessa geenien ilmentymisen havaittiin muuttuvan kun kasvusto altistettiin lämpösokille sekä sitä seuraavalle kasvulämpötilan nostolle 45 °C:een. Näitä geeni-ilmentymisen muutoksia tutkittiin DNA-mikrosirumenetelmällä. Lämpöstressin todettiin aktivoivan luokan I ja III lämpösokkigeenejä, sekä geenejä jotka osallistuvat solun DNA-vaurioiden korjaamiseen. Korkea lämpötila vaimensi myös botulinumneurotoksiinia koodaavan botA -geenin sekä siihen liittyvien muiden geenien ilmentymistä. Lämpösopeutumisen aikana ja sen saavuttamisen jälkeen havaittiin liikkuvuuteen ja ympäristön kemiallisten ärsykkeiden aistimiseen liittyvien geenien ilmentymisen voimistuneen. Samalla bakteerin lepomuotojen eli itiöiden muodostumiseen liittyvien geenien ilmentyminen heikentyi. Lämpötilan todettiin aktivoivan myös eri säätelygeenejä, joiden arvellaan parantavan C. botulinum ATCC 3502 -kannan lämmönsietokykyä