Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis bei Rindern in unterschiedlichem Alter

Im Rahmen eines früheren, von der Bundesanstalt für Landwirtschaft geförderten Innovationsprojekts über die "Frühdiagnostik von Infektionen mit Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) bei Rindern" (BLE-Förderkennzeichen 28-1-32.006-06) waren 47 weibliche Kälber der Rasse Deutsche Holstein im Alter von ca. 100 Lebenstagen auf eine MAP-Infektion untersucht worden. Bei dem Probenmaterial handelte es sich einerseits um laparoskopisch entnommene Biopsate aus den Ileozäkal- und Jejunallymphknoten, welche zum einen mittels Triplex Real-time PCR (RT-PCR; Schönenbrücher et. al, 2008), zum anderen kulturell auf MAP untersucht worden waren. Zusätzlich waren Serumproben dieser Kälber mittels Pourquier®-ELISA auf MAP-Antikörper geprüft worden. Ziel der jetzigen Untersuchungen war die Überprüfung des MAP-Status der aus dieser früheren Studie noch zur Verfügung stehenden 27 Rinder. Von diesen stammten 20 aus Paratuberkulose-positiven und 7 aus Paratuberkulose-unverdächtig eingestuften Milchviehbeständen. Bei drei dieser 27 Kühe war im Kälberalter MAP in den Darmlymphknoten nachgewiesen worden, bei einem weiteren hatte diese Untersuchung zu einem fraglichen Real-time-PCR-Ergebnis geführt. Zum Zeitpunkt der ersten Nachbeprobung waren diese Tiere mittlerweile zwischen 36 und 41 Monate alt (Durchschnittsalter 38,9 Monate). Zur Ermittlung des MAP-Status wurden aus dem Rektum entnommene Kotproben kulturell (HEYM) sowie mittels Triplex-Real-time-PCR auf diesen Erreger untersucht. Zusätzlich wurden Blutproben mittels Pourquier®-Paratuberkulose ELISA (Pourquier® ELISA Paratuberculosis Antibody Screening Testkit, Fa. Institut Pourquier, Montpellier, Frankreich) auf MAP-Antikörper getestet. Diese Untersuchungen wurden im Rahmen der zweiten Nachbeprobung drei Monate später wiederholt. Zusätzlich wurden bei allen Probenden an beiden Terminen der Body Condition Score, die innere Körpertemperatur, die Herz- und Atemfrequenz sowie die Kotbeschaffenheit registriert. Weiterhin konnten bei zwei im Kälberalter MAP-positiven Kühen anlässlich der Schlachtung im Alter von jeweils 50 Monaten nochmals Kotproben sowie Organmaterial (Ileozäkal- und Jejunallymphknoten, Ileozäkalklappe, Ileum, Colon, Milz, Tonsillen) zur Untersuchung auf MAP entnommen werden. Diese Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: Die zwei im Kälberalter kulturell und molekularbiologisch MAP-positiven Tiere (eines davon zusätzlich auch seropositiv), erwiesen sich bei den beiden Nachbeprobungen mittels kultureller und molekularbiologischer Kotuntersuchung als negativ. Gleiches galt für die Serologie. Das weitere Tier, bei dem im Kälberalter MAP nur mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte, wobei dieses Tier damals auch seropositiv war, erwies sich in beiden Nachbeprobungen im Erreger- wie Antikörpernachweis als negativ. Von den zwei Tieren, bei denen die Lymphknotenuntersuchung mittels Real-time PCR im Kälberalter zu einem fraglichen Ergebnis geführt hatte, stand nur noch eines für die Nachuntersuchungen zur Verfügung. Bei dieser Kuh ließ sich MAP bei der 2. Nachbeprobung im Kot kulturell nachweisen, die Real-time PCR ergab ein fragliches Ergebnis. Von den zwei geschlachteten Kühen erwies sich ein Tier in allen Tests als MAP-negativ. Bei der anderen Kuh gelang der direkte Erregernachweis hingegen sowohl im Kot und Darminhalt, als auch in verschiedenen Organen. Von den noch zur Verfügung stehenden 23 Tieren, welche im Kälberalter als MAP-negativ getestet worden waren, erwiesen sich auch bei den Nachbeprobungen 21 Kühe weiterhin als negativ. Bei einem dieser ursprünglich negativen Tiere konnte MAP bei der 2. Nachbeprobung kulturell nachgewiesen werden, die Real-time PCR lieferte ein fragliches Ergebnis. Bei einem anderen Tier, bei welchem im Kälberalter weder der direkte noch indirekte Nachweis einer MAP-Infektion gelungen war, wurde bei der 2. Nachbeprobung ein serologisch fragliches Ergebnis erzielt. Alle anderen Tiere erwiesen sich sowohl im Kälberalter als auch in den Nachbeprobungen als molekularbiologisch, kulturell und serologisch negativ. Die Aussage dieser Studie hinsichtlich der diagnostischen Bedeutung einer Frühuntersuchung von Kälbern auf MAP anhand von Lymphknotenbiopsaten wird dadurch eingeschränkt, dass für die beiden Nachbeprobungen nur noch vier von fünf der im Kälberalter als positiv oder fraglich getesteten Tiere zur Verfügung standen. Da anlässlich dieser Nachuntersuchungen nur noch bei zwei dieser vier Rinder MAP nachgewiesen werden konnte, könnte geschlussfolgert werden, dass manche der im Kälberalter MAP-positiven Tiere im weiteren Verlauf in der Lage sind, diesen Erreger wieder zu eliminieren oder zumindest abzukapseln. Umgekehrt deutet der Befund, dass bei einem der im Kälberalter negativ getesteten Tiere bei der späteren Nachbeprobung MAP nachgewiesen werden konnte, darauf hin, dass sich Rinder vermutlich auch noch nach dem 100. Lebenstag mit dem Paratuberkuloseerreger infizieren können. Sehr groß scheint diese Gefahr jedoch nicht zu sein, da bei allen übrigen 21 ursprünglich negativen Rindern anlässlich dieser Nachbeprobungen kein Hinweis auf eine MAP-Infektion festgestellt werden konnte.Within the framework of an earlier innovation project on the “early diagnosis of infections with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) in cattle (BLE-Project code 28-1-32.006-06) which was funded by the Federal Insitute for Agriculture, 47 female calves of the breed German Holstein were tested for MAP infection at the age of approximately 100 days. The samples were laparoscopically taken from the ileocecal and jejunal lymph nodes and tested for MAP on the one hand using triplex real-time PCR (RT-PCR; Schönenbrücher et al., 2008) and on the other hand also as a culture. In addition, serum samples from the calves were tested for MAP antibodies using Pourquier® ELISA. The aim of the present study was to review the MAP status of the 27 cattle still available from this earlier study. Of these, 20 came from paratuberculosis-positive and 7 from paratuberculosis-negative classified dairy cattle herds. MAP had already been detected in the intestinal lymph glades of three from 27 cows during calf age. The samples from one other cow led to a questionable real-time PCR result. At the time of the first retests, the animals were between 36 and 41 months old (average age 38.9 months). To determine the MAP status, faecal samples from the rectum were analyzed culturally (HEYM) as well as using triplex real-time PCR to test for this pathogen. In addition, blood samples were tested for MAP antibodies by the means of Pourquier® paratuberculosis ELISA (Pourquier® ELISA Paratuberculosis Antibody Screening Testkit, Institut Pourquier, Montpellier, France). These tests were repeated three months later. In addition, the body condition score, internal body temperature, cardiac and respiratory frequency as well as faeces-quality were registered for all test subjects at both dates. Furthermore, two cows which had been tested MAP-positive as calves, before slaughter at the age of 50 months, were retested for MAP using faecal samples as well as organ material (ileocecal and jejunal lymph nodes, ileocecal valve, ileum, colon, spleen, tonsils). The investigations gave the following results: The two animals, which had been tested culturally and molecular biologically MAP-positive in the calf age (one of them also seropositive) proved to be negative in the two re-tests by means of cultural and molecular biologycally faeces examination. The same was proven through serology. Both retests from the cow where MAP had been only detected by means of RT-PCR at calf age, but which also had been seropositive, showed up negative in both pathogen and antibody detection. Of the two animals in which the lymph gland examination using Real-time PCR in the calf age led to a questionable result, only one was available for the follow-up examinations. In this cow, MAP was culturally detectable in the second retesting of the faeces, but the real-time PCR yielded a questionable result. Of the two slaughtered cows, one animal proved to be negative in all tests. In the other cow, however, direct pathogen detection was registered both in faeces and intestines, as well as in various organs. Of the 23 animals, which were still available and which had been tested as MAP-negative as a calf, 21 of them were also found to be still negative in the retesting. In one of these originally negative animals, MAP could be proved culturally at the second retesting although the real-time PCR yielded a questionable result. One animal, where the direct or indirect detection of MAP infection had not been successful as a calf, a serologically questionable result was obtained in the second retest. All other animals proved to be molecular biologically, culturally and serologically negative both in the calve age as well as in the retests. The overall results of this study regarding the diagnostic significance of an early MAP screening by means of a lymph nodes biopsies are restricted by the fact that only four out of five of the calves tested with a positive or questionable result were available for the two retests. Since only two of these four cattle were tested MAP -positive during these follow-up studies, it could be concluded that some of the MAP-positive animals in the calf age are subsequently able to eliminate or at least isolate this pathogen. Vice versa, the result that one of the animals negatively tested in the calf age was now positively tested during subsequent post-sampling, suggests that bovines can be infected with the paratuberculosis agent even after the 100th day of life. However, the risk does not appear to be very great, since no other signs of MAP-infection could be detected for all other 21 originally negative cattle during these retests