Polystyrene microplastics accumulation and biomarkers response in Scrobicularia plana

Dissertação de mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016Nowadays there is an increasing resilience of plastics as an everyday item. With the rapid increase in their production and spread, plastic debris are accumulating in the marine environment where they are fragmented into smaller pieces. One of the most produced polymer, and accordingly, more common in the marine environment is the polystyrene (PS). Ranges of organisms, especially invertebrates, are vulnerable to the exposure of microparticles. However, the impacts of microplastics (< 5mm) in the marine systems are poorly understood. The aim of this study was to assess the ecotoxicity of PS microplastics in different tissues of the peppery furrow shell Scrobicularia plana and select the most appropriate biomarkers to evaluate microplastics effects. Clams were exposed to 1 mg L-1 of PS microplastics (20 μm) for 14 days, followed by a 7 days depuration. Microplastics accumulation in gills and digestive gland was analysed through Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy (DRIFT) and their effects by a battery of biomarkers of oxidative stress (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidases and glutathione-S-transferases), genotoxicity (comet assay to evaluate DNA damage), neurotoxicity (acetylcholinesterase activity) and oxidative damage (lipid peroxidation). Results indicate that microplastics were accumulated in both organs, but more significant in the gills and were not completely eliminated after 7 days of depurarion. Microplastics accumulation induced an oxidative stress response in both tissues. The overall results on oxidative stress biomarkers indicated that short-term exposure to PS microplastics induce major perturbations, as revealed by the effects on the total antioxidant capacity, DNA damage, neurotoxicity and thus oxidative damage. The results highlighted the potential source of PS toxicity for human health and the marine environment and that S.plana is a significant target of PS microplastics ecotoxicity and can be a suitable biomonitor for assess their environmental risk.Hoje em dia há uma resiliência crescente dos plásticos como um item do dia-a-dia para fins comerciais, industriais e terapêuticos. No entanto, a sua produção, o rápido crescimento e distribuição tem dado origem a sérias implicações ambientais. O consumo de plásticos em muitos países europeus indica que as resinas plásticas mais utilizadas desde 2007 são polietileno de baixa densidade (PEBD) e polietileno de alta densidade (HDPE), polipropileno (PP), cloreto de polivinilo (PVC), polietileno tereftalato (PET) e poliestireno (PS). O poliestireno (PS) é um dos plásticos mais utilizados em todo o mundo e tem sido detetado nos oceanos sob a forma de micro e nano partículas. Tem-se verificado que o PS tem um impacto ambiental considerável, nomeadamente em espécies marinhas. Recentemente, foram identificadas no ambiente marinho partículas microscópicas omnipresentes - os microplásticos - definidos como partículas com menos de 5 mm de diâmetro, de acordo com a National Oceanic and Atmospheric Administration dos Estados Unidos da América. São considerados um poluente marinho emergente e, até à data, têm sido detetados em muitos habitats e numa variedade de espécies marinhas e de água doce. Assim, é importante entender a sua distribuição no ambiente marinho e as implicações sobre os habitats, biodiversidade e bem-estar das espécies marinhas. Os efeitos biológicos dos microplásticos nos organismos dependem do seu tamanho sendo que, quanto menor, maior será a acumulação e o efeito a nível celular. Apesar da preocupação relacionada com a ingestão, os efeitos dos microplásticos em populações marinhas e as suas implicações para a cadeia alimentar ainda não são bem conhecidos. Os invertebrados marinhos são particularmente suscetíveis aos microplásticos, por causa do tamanho e modo de alimentação. Uma vez que o modo de ação e o risco biológico dos microplásticos ainda não são muito claros, esta dissertação avaliou a acumulação e os efeitos dos microplásticos de poliestireno (20 μm) na lambujinha Scrobicularia plana, de forma a avaliar o potencial risco ecotoxicológico para os diferentes níveis de organização biológica e selecionar o biomarcador mais apropriado para determinar os efeitos dos microplásticos. Relativamente à parte experimental, após a recolha, os animais tiveram um periodo de aclimatação de 7 dias. Seguidamente foram expostos a uma concentração de PS microplásticos (1 mg L-1) durante 14 dias, juntamente com um grupo de controlo, ao qual se seguiu um período de depuração de 7 dias. Os animais foram recolhidos em diferentes dias de exposição, nomeadamente nos dias 0, 3, 7, 14 e 21. Inicialmente, as características dos microplásticos e o seu comportamento na água do mar foram analisados em termos de forma, tamanho, carga superficial (potencial zeta), agregação, turbidez e taxa de sedimentação. Seguidamente, avaliou-se a acumulação dos microplásticos nas brânquias e na glândula digestiva através da observação ao microscópio ótico das partículas presentes na hemolinfa, e pela técnica de espectroscopia por refletância difusa no infravermelho com transformação de Fourier (DRIFT). Para o estudo da toxicidade dos microplásticos de PS uma bateria de biomarcadores foi analisada nas brâquias e na glândula digestiva incluindo: stress oxidativo (superóxido dismutase - SOD, catalase - CAT, glutationa peroxidases - GPx e glutationa-S-transferases - GST), genotoxicidade (danos no ADN), neurotoxicidade (actividade da enzima acetilcolinesterase), e dano oxidativo (peroxidação lipídica). Os microplásticos usados neste estudo foram micropartículas esferóides com um tamanho de 20 ± 0.02 μm e densidade de 1.05 g cm-3. Em água do mar, os microplásticos de PS tendem a formar pequenos agregados com uma carga superficial negativa (potencial zeta = -12.4 ± 2.36 mV). A taxa de sedimentação rápida e lenta dos microplásticos na água do mar foi de 1.04 x 10-1 e 1.16 x 10-3 h-1, respetivamente, confirmando a sua tendência para sedimentar nos tanques de exposição, após as primeiras duas horas. No que diz respeito à acumulação dos microplásticos de PS nos tecidos, as brânquias apresentaram um padrão de acumulação crescente ao longo do tempo de exposição, com uma possível recuperação no final do período de depuração, através da eliminação dos microplásticos de PS quase na sua totalidade. Em relação à glândula digestiva, a acumulação de microplásticos de PS é evidente, no entanto, não apresentou o mesmo padrão de aumento observado nas brânquias. Os resultados indicaram que a acumulação foi mais eficiente nas brânquias do que na glândula digestiva. A toxicidade dos microplásticos de PS nas lambujinhas é dependente do tecido e do tempo de exposição e envolve mudanças na atividade das enzimas antioxidantes, stress oxidativo, neurotoxicidade e danos no ADN. As brânquias são o orgão que responde mais ativamente ao stress oxidativo induzido pelos microplásticos de PS, com efeitos associados ao aumento da atividade das enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx) e de biotransformação (GST). Na glândula digestiva verificou-se um aumento da atividade da SOD, CAT e GPx. Comparando as atividades das enzimas antioxidantes e de biotransformação dos dois órgãos (brânquias e glândula digestiva), a atividade da CAT foi a única que aumentou na glândula digestiva em relação às brânquias. Após o período de depuração verificou-se um aumento da atividade da SOD e GPx nas brânquias. Na glandula digestiva ocorreu um aumento da atividade da CAT e uma diminuição da atividade da GST. Verificou-se ainda um efeito genotóxico e neurotóxico causado pelos microplásticos de PS. O efeito genotóxico traduziu-se pelo aumento da percentagem de ADN presente na cauda do cometa (DNA Tail) e no comprimento da cauda do cometa e pela proporção de ADN presente na cauda (Olive Tail Moment). Também no período de depuração se verificou um aumento para estes dois parâmetros. O efeito neurotóxico dos microplasticos de PS é suportado pela diminuição da atividade da acetilcolinesterase após o primeiro dia de exposição. De uma forma geral, o dano oxidativo foi maior na glândula digestiva do que nas brânquias. Nas brânquias o dano foi menor após o ínicio da exposição aos microplásticos. Na glândula digestiva verificou-se um aumento progressivo até ao 7º dia. Após o período de depuração, apenas se verificaram diferenças significativas na glândula digestiva, com uma diminuição do nível de LPO em relação ao ultimo dia de exposição (dia 14). Analisando os resultados no seu conjunto, as brânquias aparentam ser um órgão essencial na proteção de S. plana contra o efeito dos microplásticos de PS, uma vez que a resposta das enzimas antioxidantes e de biotransformação foi mais notória neste orgão do que na glândula digestiva, traduzindo-se numa maior toxicidade. Estes resultados indicam que, possivelmente, S. plana lida com a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) através da indução das defesas antioxidantes, o que, por conseguinte, limita o ataque de ROS nas membranas celulares, impedindo que haja peroxidação lipídica nas brânquias. O período de depuração não parece ser suficiente para a eliminação dos microplásticos de PS. Durante o período de depuração, as brânquias de S. plana aparentam possuir baixa capacidade de eliminação de PS, sendo o principal órgão de contacto com os microplásticos, enquanto que a glândula digestiva parece eliminar mais facilmente as micropartículas