Charakterisierung eines universellen 'Cyclase-Transducer-Elements' (CTE) in Klasse IIIa Adenylatcyclasen

Signaltransduzierende Membranproteine besitzen zwischen Rezeptor- und Effektor-domäne oft signalmodulierende Domänen wie HAMP, S-Helix oder Cyclase-Transducer-Element (CTE). Aufgrund dieses Aufbaus wird ein ähnlicher Mechanismus der Signaltransduktion vermutet, der funktionelle Austausch von Domänen wurde mit einer möglichen universellen Sprache gedeutet. Auch Adenylatcyclasen besitzen solche Signalwandlermodule, eine direkte Regulation von ACn durch Liganden wurde bislang nicht bewiesen. Hier wurden funktionelle chimäre ACn hergestellt, bei denen der hexahelikale TM 'Quorum-Sensing Receptor' LqsS aus Legionella pneumophila den hexahelikalen TM Membrananker der mykobakteriellen AC Rv1625c ersetzt. Als Verknüpfungsposition des LqsS Rezeptors an die Rv1625c AC wurden auf der LqsS Seite viele Anknüpf-positionen toleriert. Dabei trat sowohl Stimulation als auch Hemmung durch den Liganden LAI-1 auf. Auf der Rv1625c Seite wurden nur wenige Anknüpfpositionen toleriert. Mit abnehmender Länge von Rv1625c nahm die Basalaktivität der AC drastisch ab. Es wurde die Fragestellung der funktionellen Eigenständigkeit der S Helix bearbeitet. Hierfür wurde die S-Helix mit HAMP Domänen von Tsr, Af1503 und CyaG sowie den CHD Effektordomänen von Rv3645, Rv1625c und CyaG kombiniert. Mit den N terminalen Rezeptoren Tsr bzw. LqsS wurde die Regulation durch die Liganden Serin bzw. LAI-1 untersucht. Meist wurde die signalinvertierende Eigenschaft der S Helix bestätigt, d.h. ihre Funktion als eigenständiges Modul. Mit der CHD von Rv3645 wurden keine regulierten Chimären erhalten, vielleicht mangels Kompatibilität zwischen S-Helix und einer Klasse IIIb AC. Bei der Untersuchung der Kommunikation von S-Helix und CTE wurde die signalinvertierende Eigenschaft der S-Helix als positionsabhängig festgestellt. Unter Einbezug aller Ergebnisse wurde erstmals das 20 ASn lange Cyclase-Transducer-Element biochemisch charakterisiert. Neben einem mittig gelegenen, invarianten Prolin, das vermutlich die helikale Struktur unterbricht, besitzt die CTE eine ausgeprägte Sequenzkonservierung. Die Austauschbarkeit der bakteriellen Rv1625c-CTE mit der ACV_CTE1 bzw. der ACV_CTE2 von Wirbeltieren wurde untersucht. Jede Veränderung der Rv1625c-CTE resultierte in einem Aktivitätsverlust. Es wurde gezeigt, dass sich N bzw. C-terminale Modifikationen der CTE unterschiedlich auswirken. Die Daten deuten darauf hin, dass CTE's auf ihre umgebenden Domänen abgestimmt sind und eine asymmetrische Funktion in der Signaltransduktion einnehmen. Dies stützt die Hypothese der direkten Regulation von ACn, welche in Eukaryoten zusätzlich zur indirekten Regulation durch GPCRn erfolgen würde