Molecular analysis of the response of Pinus pinaster plants with differential behavior towards the Pine Wood Nematode infection

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em PlantasThe Pine Wood Nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus is the causal agent of Pine Wilt Disease (PWD), which threatens several conifer species around the world leading to great ecological and economical losses. Pinus pinaster (maritime pine), one of the major forest species in Portugal, is susceptible to the PWN infection. The importance of controlling the evolution of the disease as well as its spreading to other countries motivated the initiation of a national breeding program to address this problem. Over five hundred adult trees have been selected as candidate PWN resistant trees for this program from a PWD highly affected area. In this study, seedlings derived from a candidate resistant tree were used in an inoculation experiment to assess susceptibility/tolerance to PWN infection. From the set of inoculated plants, some apparently tolerant plants were selected along with susceptible ones to conduct expression analyses of selected transcripts potentially involved in the response mechanisms against PWN infection, and that might explain the susceptibility or tolerance towards PWD. Samples from the selected susceptible and tolerant P. pinaster plants were sent for small RNA and degradome next-generation sequencing. Differential expression analysis of the identified small RNAs between susceptible and tolerant plants was performed, and target transcripts for the differentially expressed small RNAs were predicted using computational approaches. Transcripts were also selected from a previous study that identified expressed sequence tags differentially expressed in P. pinaster susceptible plants versus plants from a tolerant species, Pinus pinea, inoculated with PWN. Expression analysis of small RNA targets and transcripts putatively involved in the response mechanism to PWD allowed the identification of genes with different expression profiles between susceptible and tolerant P. pinaster plants, that are apparently linked to the differential behavior of those plants to PWN infection. This study provides valuable information for future research to elucidate the response mechanisms to PWD, and to identify potential marker genes that, linked to a marker-assisted selection of trees, can be an effective approach to accumulate tolerance-related genes in a population or an individual, and contribute to the future establishment of pine forests tolerant to the PWD.O Nemátode da Madeira do Pinheiro (NMP) Bursaphelenchus xylophilus é o agente causal da Doença da Murchidão do Pinheiro (DMP), que ameaça várias espécies de coníferas em todo o mundo levando a grandes perdas ecológicas e económicas. Pinus pinaster (pinheiro bravo), uma das principais espécies florestais em Portugal, é suscetível à infeção pelo NMP. A importância de controlar a evolução da doença, bem como a sua propagação para outros países motivaram o início de um programa de melhoramento nacional para fazer face a este problema. Mais de quinhentas árvores adultas foram selecionadas como árvores candidatas resistentes ao NMP, no âmbito deste programa, de uma área altamente afetada pela DMP. Neste trabalho, plantas jovens provenientes de uma árvore candidata resistente foram usadas num ensaio de inoculação para avaliar a suscetibilidade/tolerância à infeção com o NMP. Das plantas inoculadas, foram selecionadas algumas plantas aparentemente tolerantes à infeção, juntamente com algumas suscetíveis, para realizar análises de expressão de transcritos potencialmente envolvidos nos mecanismos de resposta à infeção com o NMP, e que poderão explicar a suscetibilidade ou tolerância à DMP. Amostras das plantas de P. pinaster suscetíveis e tolerantes selecionadas foram enviadas para sequenciação de nova geração de pequenos RNAs e do degradoma. A análise da expressão diferencial dos pequenos RNAs identificados entre plantas suscetíveis e tolerantes foi efetuada, e transcritos-alvo dos pequenos RNAs diferencialmente expressos foram previstos usando abordagens computacionais. Também foram selecionados transcritos de um estudo anterior que identificou “expressed sequence tags” diferencialmente expressas em plantas suscetíveis de P. pinaster versus plantas de uma espécie tolerante, Pinus pinea, inoculadas com o NMP. A análise de expressão dos alvos de pequenos RNAs e transcritos putativamente envolvidos no mecanismo de resposta à DMP permitiu a identificação de genes com diferentes perfis de expressão entre plantas de P. pinaster suscetíveis e tolerantes, que estão aparentemente relacionados com o comportamento diferencial destas plantas face à infeção com o NMP. Este estudo fornece informação importante para futura investigação relativa aos mecanismos de resposta à DMP e para a identificação de potenciais genes marcadores que, ligada a uma seleção de árvores assistida por marcadores, poderá ser uma estratégia efetiva para acumular genes relacionados com a tolerância numa população ou indivíduo, e contribuir para o estabelecimento futuro de florestas de pinheiros tolerantes à DNP