Atividade antigenotóxica e anticancro de extratos de plantas utilizando diferentes modelos de células eucarióticas

Dissertação de mestrado Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em PlantasIn the last decades, the interest in medicinal plants has increased significantly owing to the antioxidant properties found in their natural extracts, which are responsible for many therapeutic effects. Therefore, there has been a great demand in discovering novel compounds, in order to develop new products (e.g. pharmaceuticals, cosmetics and dietary) characterized by high efficiency and low toxicity. Genotoxic stress might be induced by external and internal factors, causing serious damage since many cellular events, such as replication and transcription, depend on DNA integrity. The colonic epithelium is continuously exposed to a large diversity of dietary compounds, some of them potentially carcinogenic, that may affect DNA integrity (e.g. DNA oxidation and strand breaks) and alter cell genetic information, contributing to the development of colorectal cancer (CRC). Diets that are mainly based on polyphenols have been associated with CRC prevention. Medicinal plant extracts may also be rich in polyphenols and can be used to prevent DNA damage. In this work, eukaryotic cellular models were used to assess the antigenotoxic activity of medicinal plant extracts known for their strong antioxidant activity: Ginkgo biloba (GBE) and Dittrichia viscosa (DVE). The extracts demonstrated protective effect in co-incubation with the clastogenic agent camptothecin, in viability assays using the yeast Schizosaccharomyces pombe. This effect suggests an antigenotoxic role for the extracts, which may result from the stimulation of DNA repair through the homologous recombination pathway. Moreover, the antigenotoxic effect of GBE and its digested product (DGBE), obtained through in vitro simulation of the human digestion, was investigated in the human colorectal adenocarcinoma cell line HT-29 against oxidative stress, using the comet assay. The results suggested that pre-treatment with GBE or DGBE protected the DNA from deleterious effects induced by the oxidizing agent H2O2, probably due to stimulation of antioxidant defence mechanisms and DNA repair or through induction of mild stress in cells, which caused adaption to oxidative stress. The antigenotoxic effect of GBE and DGBE can be antioxidantmediated, which is in accordance with the results of the in vitro antioxidant assays of iron chelation and scavenging of the radicals 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl and nitric oxide and studies of intracellular oxidation with the fluorochrome 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate by flow cytometry, in Sch. pombe. Thus, DVE and GBE demonstrated protective effect against clastogenic damage and GBE protected the DNA from oxidative effects, an effect retained after the digestion, suggesting that GBE could be used in the prevention of CRC.Nas últimas décadas, o interesse em plantas medicinais tem aumentado significativamente devido às propriedades antioxidantes encontradas nos seus extratos naturais, as quais são responsáveis por muitos efeitos terapêuticos. Consequentemente, tem havido uma grande procura de novos compostos de modo a desenvolver novos produtos (ex: farmacêuticos, cosméticos e dietéticos) caraterizados por alta eficiência e baixa toxicidade. Stresse genotóxico pode ser induzido por fatores externos e internos, causando sérios danos visto que muitos eventos celulares, como a replicação e a transcrição, dependem da integridade do DNA. O cólon é continuamente exposto a uma grande diversidade de compostos dietéticos, alguns potencialmente carcinogénicos, que podem afetar a integridade do DNA (ex: oxidação do DNA e quebras de cadeia) e alterar a informação genética das células, contribuindo para o desenvolvimento de cancro colorretal (CRC). Dietas maioritariamente baseadas em polifenóis têm sido associadas à prevenção de CRC. Extratos de plantas medicinais podem também ser ricos em polifenóis e podem ser usados para prevenir danos no DNA. Neste trabalho, modelos celulares eucarióticos foram usados para avaliar a atividade antigenotóxica de extratos de plantas medicinais conhecidos pela sua forte atividade antioxidante: Ginkgo biloba (GBE) e Dittrichia viscosa (DVE). Os extratos demonstraram efeito protetor em co-incubação com o agente clastogénico camptotecina, em ensaios de viabilidade com a levedura Schizosaccharomyces pombe. Este efeito sugere um papel antigenotóxico para os extratos, o qual pode resultar da estimulação da reparação do DNA através da via de recombinação homóloga. Adicionalmente, o efeito antigenotóxico de GBE e do seu produto digerido (DGBE), obtido por simulação da digestão humana in vitro, foi investigado na linha celular humana de adenocarcinoma colorretal HT-29 contra stresse oxidativo, usando o ensaio cometa. Os resultados sugeriram que pré-tratamento com GBE ou DGBE protegeu o DNA de efeitos oxidantes induzidos por H2O2, provavelmente devido à estimulação dos mecanismos de defesa antioxidante e reparação de DNA ou através da indução de stresse moderado nas células, o qual pode causar adaptação ao stresse oxidativo. O efeito antigenotóxico de GBE e DGBE pode ser mediado pela atividade antioxidante, o que está de acordo com os resultados dos ensaios antioxidantes in vitro de quelação de ferro e scavenging dos radicais 2,2- difenil-1-picrilhidrazil e óxido nítrico e estudos de oxidação intracelular com o fluorocromo 2',7'- diclorodihidrofluoresceína diacetato por citometria de fluxo, em Sch. pombe. Assim, DVE e GBE demonstraram efeito protetor contra dano clastogénico e GBE protegeu o DNA de danos oxidativos, um efeito retido após a digestão, sugerindo que GBE poderia ser usado na prevenção de CRC