Optimization of γ-decalactones production by genetically modified strains of Yarrowia lipolytica

Dissertação de Mestrado em BioengenhariaNo final dos anos 80, os compostos aromáticos produzidos por processos biotecnológicos, tornaram-se muito procurados pelos consumidores. Estes compostos têm uma variedade de aplicações de interesse sensorial (sistema olfativo), como em bebidas, cosméticos e na indústria do papel. A biotransformação do ácido ricinoleico através de microrganismos, como Yarrowia lipolytica, é um processo interessante para produzir compostos aromáticos com cariz “natural”. A γ-decalactona é um composto aromático de interesse industrial e possui um aroma cremoso e frutado a pêssego. Este pode ser obtido pela β-oxidação peroxissomal do ácido ricinoleico, usando óleo de rícino como substrato. A levedura Y. lipolytica possui uma família de enzimas, as Acil-CoA oxidases, que são codificadas pelos genes POX1 até POX6 e desempenham um papel importante na β-oxidação do ácido ricinoleico. Vários estudos notaram que o gene POX2 parece degradar os ácidos gordos de cadeia longa (C18 to C10) e o POX3 os ácidos gordos de cadeia curta, sendo que os quatro restantes ainda não têm funções claras. O objetivo deste trabalho foi estudar o desempenho de estirpes mutantes derivadas da estirpe selvagem W29, MTLY40-2P (sobreexpressa o gene POX2) e a JMY3010 (sobreexpressa o gene LIP2), sob diferentes condições de operação em bioreatores: concentrações celulares e de óleo de rícino, modo de operação (descontínuo ou descontínuo repetido) e tipo de bioreator (STR ou Air-lift). Além disso, foi estudado pela primeira vez o uso de culturas mistas com ambas as estirpes com o objetivo de melhorar a biotransformação. Concluiu-se que o aumento da densidade celular de 20 g L-1 para 40 g L-1 não melhorou o processo, mas o aumento de óleo de rícino de 30 g L-1 para 60 g L-1 teve um efeito positivo na produção de aroma para ambas as estirpes. As culturas mistas em batch (MTLY40-2P e JMY3010) levadas a cabo com 20 g L-1 de densidade celular e 60 g L-1 de óleo de rícino, obtiveram os melhores resultados para a produção de γ-decalactona (1844 ± 46 mg L-1) e produtividade (80 ± 5 mg L-1 h-1). A biotransformação em descontínuo repetido não melhorou o processo, provavelmente por efeitos tóxicos do substrato ou limitação do oxigénio. A cultura mista descontínua realizada em bioreator air-lift, efetuada com as melhores condições de crescimento celular e óleo de rícino obtidas no STR, conduziu a valores semelhantes de concentração de γ-decalactona, mas o processo foi mais lento. Por fim, foram realizadas biotransformações descontínuas em frasco de pequena escala e mostraram que a possível acumulação de glicerol no meio, devido à hidrólise do óleo de rícino, tem um pequeno impacto na produção de γ-decalactona e algumas melhorias no processo poderão ser alcançadas através de alterações na composição do meio, tal como o uso de ureia como fonte de azoto.In the final of 80’s, aromatic compounds produced by biotechnological processes, have become preferred by consumers, due to natural label. These compounds have a variety of applications of sensorial interest based on the olfactory system, such as in food, drinks, cosmetics and paper industry. The biotransformation of ricinoleic acid carried out by microorganisms, such as Yarrowia lipolytica, is an interesting process to produce aroma compounds with a “natural” label. γ-decalactone is an aromatic compound of industrial interest and possesses a creamy and fruity aroma to peach. It can be obtained from the peroxissomal β-oxidation of ricinoleic acid, using castor oil as natural substrate. Y. lipolytica possesses a family of enzymes called Acyl-CoA oxidases, Aox, which are encoded by POX1 to POX6 genes and play a very important role in β-oxidation of ricinoleic acid. Several studies observed that POX2 seems to degrade long-chain fatty acids (C18 to C10) and POX3 degrade short-chain fatty acids, and the other four have not so clear functions. This work aimed to study the performance of mutant strains derived from wild-type W29, MTLY20-2P strain overexpressing POX2 gene and JMY3010 that overexpresses LIP2 gene, under different conditions of operation in bioreactors: cellular and castor oil concentration, operation mode (batch or step-wise fed-batch) and bioreactor type STR or air-lift. Moreover, for the first time a co-culture of both strains was used in order to improve biotransformation. It was concluded that cell density increase from 20 g L-1 to 40 g L-1 did not improve the process, but the increase of castor oil from 30 g L-1 to 60 g L-1 had positive effects on aroma production for both strains. Batch co-cultures of Y. lipolytica mutant strains (MTLY40-2P and JMY3010) obtained with 20 g L-1 of total cellular density and 60 g L-1 of castor oil concentration led to the best results of γ-decalactone production (1844 ± 46 mg L-1) and productivity (80 ± 5 mg L-1 h-1). Step-wise fed-batch biotransformation did not improve the process probably due to toxic effects of castor oil increase or due to oxygen limitation. Batch co-culture carried out in air-lift bioreactor using the best conditions for cell growth and castor oil biotransformation obtained at STR led to similar values of maximum γ-decalactone concentration, but the process was slower. Finally, batch biotransformation in small scale flasks were performed and shown that the possible accumulation of glycerol in the medium, due to castor oil hydrolysis, has small impact on γ-decalactone production, and further improvements on the process may be achieved through medium composition changes such as the use of urea as nitrogen source