CHARACTERIZATION OF MICROBIAL BIODIVERSITY IN FERMENTED COCOA BEANS

La qualità delle fave di cacao disponibili in commercio, che rappresentano la principale materia prima per la produzione di cioccolato, dipende da diversi fattori inclusi: il tipo di piantagione, le pratiche agricole ed il processo di post raccolta. Tra queste; fermentazione ed essicazzione sono generalmente considerate le più rilevanti, dal momento in cui, durante queste fasi, vengono formati e fissati i precursori degli aromi del cacao. Inoltre, esse rappresentano un step cruciale durante il quale possono verificarsi contaminazioni da parte dei funghi filamentosi. La fermentazione è caratterizzata da una successione ben definita di lieviti, batteri lattici e batteri acetici, a tal fine, lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di esplorare e descrivere in modo completo le comunità batteriche e fungine coinvolte nella fermentazione delle fave di cacao e valutare se l’origine geografica ed il metodo di fermentazione potessero influenzare la loro composizione. Per ottenere tali risultati il gene 16s rRNA è stato usato come marker per descrivere la comunità batterica totale mediante High Throughput Sequencing (HTS), dimostrando come tale approccio abbia la capacità di evidenziare la totalità delle comunità batteriche a livello di specie. In un secondo approccio l’Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) ed il dominio D1/D2 della sub unità maggiore dell’RNA ribosomiale (26s rRNA) sono stati selezionati per descrivere la popolazione fungina. I risultati hanno evidenziato come le due regioni abbiano la capacità di descrivere la composizione generale delle popolazioni, sebbene il dominio D1/D2 sia stato in grado di analizzare più nel dettaglio la composizione. Infine gli stessi campioni sottoposti all’analisi mediante HTS sono stati analizzati mediante SPME-GC-MS per evidenziare i principali composti aromatici formatisi durante il processo di post raccolta. Complessivamente i risultati indicano chiaramente che l’approccio mediante HTS ha le potenzialità per fornire una dettagliata visione d’insieme delle comunità batteriche e fungine presenti durante le fasi di post raccolta delle fave di cacao, inoltre le analisi statistiche hanno evidenziato come l’ITS1 ed i composti volatili possano essere utilizzati per la tracciabilità geografica.The quality of commercial cocoa beans, the principal raw material for chocolate production, depends on several factors including type of plantations, the agricultural practices and the post-harvest processing. Among these, fermentation and drying are generally considered the most relevant, since during these phases cocoa flavors precursors are formed and fixed. Furthermore, they represent crucial steps during which filamentous fungi contamination might occur. Fermentation is characterized by a well-defined succession of yeasts, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria, so that, the aim of the described studies was to explore total bacterial and fungal communities involved in cocoa bean fermentation and to evaluate if geographical origin and fermentation method might affect their composition. To achieve these results, 16s rRNA gene was used as marker to assess the total bacterial community by using High Throughput Sequencing (HTS), indicating that this approach has the ability to provide a comprehensive view of the cocoa bean microbiota at the species level. In a second approach, Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) and the D1/D2 domain of the Large subunit (LSU) of the nuclear ribosomal RNA (26S rRNA) were screened to assess the total fungal community. Results revealed the ability of these two genomic regions to describe reliably the general composition, even if D1/D2domain was able to go deeper into the fungal composition resulting in a higher resolution. In the last approach the same samples subjected to HTS investigation were analyzed through SPME-GC-MS in order to underline the principal key-aroma compounds formed during the post-harvest processing. Overall, results point out clearly that HTS approach has the ability to provide a comprehensive view of the total bacterial and fungal communities, and statistical analyses have shown how analyses of ITS1 sequences and volatile compounds might be useful for the geographical traceability of the processed cocoa beans samples