Selbst-assemblierte Perylenbisimid-Dimere und ihre Wechselwirkung mit DNA

The self-assembly of molecules based on π-π-interactions and hydrogen bonding is of significant importance in nature. These processes enable the formation of complex supramolecular structures with diverse functions. For the transfer of the concepts from nature to artificial supramolecular structures, a basic understanding of those processes is needed. For this purpose, π-conjugated aromatic molecules with an easy synthetic access are suitable as their functionalities can be changed effortless. Perylene bisimide (PBIs) dyes are attractive candidates since they fulfill these requirements owing to their tendency to self-assemble in solution due to their large aromatic π-surfaces. Furthermore, the changes of the optical properties (for instance absorption, emission or circular dichroism) of PBI dyes, caused by their self-assembly, are easy to study experimentally. Structural variations of PBI dyes including additional non-covalent interactions, such as hydro-gen bonding, enable to direct their self-assembly process. Thus, the formation of interesting su-pramolecular structures of PBI dyes could be realized, although, often of undefined size. The aim of this thesis was to develop strategies to restrict the aggregate size of PBI dyes. Therefore, de-fined structural features of PBI molecules were combined and a variation of external influences such as solvent and concentration included. Furthermore, DNA was utilized as a template for the limitation of the aggregate size of PBI dyes. Chapters 1 and 2 provide general information and describe examples from literature which are necessary to understand the following experimental work. The first chapter is based on the inter-actions of various molecules with DNA. Therefore, DNA is considered as a supramolecular biom-acromolecule containing specific structural and functional features to interact with small mole-cules. Afterwards, the main interaction modes of small molecules with DNA such as electrostatic interaction, intercalation and groove binding with corresponding examples are discussed. Among all techniques applied to study the interaction of ligands with DNA, UV/Vis absorption, fluores-cence and circular dichroism spectroscopy were described in detail. At the end of this chapter, examples of already pre-associated systems showing interactions with DNA are presented. The second chapter is focused on the determination and mathematic evaluation of the self-assembly processes. The simplest models such as monomer-dimer and isodesmic model are de-scribed and supplemented by examples. Furthermore, the simplest modification of the isodesmic model, the K2-K model, is presented. Additionally, experimental problems, which may arise dur-ing the investigations of the self-assembly processes, are addressed. For the description of the entire self-assembly process, a sufficiently large concentration range and an appropriate measure-ment method that is sensitive in this concentration range is necessary. Furthermore, the full transi-tion from the monomeric to the aggregated species has to be spectroscopically ascertainable. This enables an accurate mathematic evaluation of the self-assembly process and provides meaningful binding constants. The self-assembly pathway can be controlled by the variation of solvent, con-centration or temperature. However, this pathway can also be directed by a rational design of the molecular structure of the considered system. For example, a specific interplay of π-π-interactions and hydrogen bonding may promote isodesmic as well as cooperative growth into large struc-tures. The main focus of this thesis is to develop strategies to control the aggregate size of PBI dyes (Chapter 3). For this purpose, a PBI scaffold was designed which contains hydrogen bonding amide functions at the imide positions derived from the amino acid L-alanine and solubilizing side groups in the periphery (Figure 81). The variations of the residues R/R’ range from didodecylox-yphenyl, didodecylphenyl, dioligo(ethylene glycol)phenyl to branched and linear alkyl chains. The most extensive study of the aggregation behavior was performed for the PBI dye 5. Concen-tration-dependent 1H NMR and UV/Vis absorption measurements clearly revealed the formation of dimers in chloroform. Further investigations by means of 2D NMR, VPO and ITC confirmed the exclusive presence of dimer aggregates of PBI 5 in the investigated concentration range. Mo-lecular modelling studies, supported by NMR and FT-IR experiments, provided structural reasons for the absence of further growth into larger aggregates. The specific combination of π-π interac-tions and hydrogen bonds between the NH groups of the amide groups and the carbonyl oxygen atoms of the PBI core are decisive for the formation of the discrete dimer stack (see Figure 82). The investigations of the aggregation behavior of PBIs 6-9 were less extensive but consistent with the results obtained for PBI 5. However, the determined binding constants vary over a considera-ble range of 1.1 x 102 M-1 (PBI 8) to 1.4 x 104 M-1 (PBI 5). These differences could be attributed to structural variations of the dyes. The electron-rich phenyl substituent promoted the aggregation tendency of PBIs 5-7 compared with 8 and 9 that carry only alkyl side chains. Thus, the π-π in-teractions of bay-unsubstituted PBI cores in combination with hydrogen bonding of the amide functions control the formation of discrete dimers of these PBI dyes. The variation of conditions, such as solvent, change the aggregation behavior of PBI dyes. In the solvents toluene and/or methylcyclohexane, anti-cooperative growth into larger aggregates of PBI 5 was observed (Chapter 4). The important feature of this self-assembly process is the absence of isosbestic points over the whole concentration range in the UV/Vis absorption measurements. The preference for the dimeric species of PBI 5 remained in both solvents as well as in mixtures of them, but upon increasing the concentration these dimers self-assemble into larger aggregates. An important feature of the self-assembly process is the preferred formation of even-numbered aggregates compared to the odd-numbered ones (see Figure 83). Although, the conventional K2-K model provides plausible binding constants, it is not capable to describe the aggregation behavior adequately, since it considers a continuous size distribution. The gradual aggregation process over dimers, tetramers, hexamers, etc. was therefore analyzed with a newly developed K2-K model for anti-cooperative supramolecular polymerization. By the global analysis of the UV/Vis absorption spectra a very good agreement between the experimental and simulated spectra, which were based on the new K2-K model, was obtained. Furthermore, the calculated UV/Vis absorption spectra of a dimer and an aggregate highlighted the most important structural differences. The absorption spectrum of the dimer still has a pronounced vibronic structure which gets lost in the spectrum of the aggregate. In another part of this work, a series of water soluble PBI dyes were described which contain similar PBI scaffolds as PBIs 5-8 (Chapter 5). These PBI dyes self-assemble into similar dimer aggregates in water due to their positively charged side chains causing electrostatic repulsion be-tween the molecules (see Figure 84). Here, however, the self-assembly behavior has not been studied thoroughly in water due to the similarities of already reported PBI dyes. Instead, the focus here is on the characterization of the interactions of these dyes with DNA/RNA. The comprehensive studies using thermal denaturation experiments showed the high stability of these PBI/polynucleotide complexes. The spermine-functionalized PBI dyes having six positive charges showed strong interactions with DNA/RNA which was expressed in a signif-icant increase of the melting temperatures of DNA/RNA (ΔTm values between 7 and > 35 ° C). The dioxa analogues containing only two positive charges had lower enhancement of the melting temperature of DNA/RNA (ΔTm values between 3 and 30 ° C). A similar trend has been observed in the fluorimetric titrations. The spermine-functionalized PBI dyes showed high binding con-stants (log Ks = 9.2 - 9.8), independently of the used polynucleotides. In contrast, the dioxa ana-logues displayed smaller binding constants (log Ks = 6.5 - 7.9) without any correlation between binding affinity and binding strength of the PBI dyes and the applied polynucleotides. The CD-spectroscopic measurements revealed significant differences in the binding properties of the dyes with DNA/RNA. They were dependent on the steric hindrance of the amino acid residues at the imide position and their configuration on one side and the grooves properties of ds-DNA/RNA on the other side. The spectroscopic results confirmed the formation of excitonically coupled PBI dimers in the minor groove of ds-DNA and the major groove of ds-RNA. Depending on the se-quence, the grooves of the polynucleotides provide different amount of space for embedding molecules. The guanine amino groups protrude into the minor groove of the polynucleotide poly(dG-dC)2 increasing the steric hindrance, which is not the case for poly(dA-dT)2. Molecular modeling studies showed that the PBI dimers penetrate deeper into the groove of poly(dA-dT)2 due to the absence of the steric hindrance, in comparison to the groove of poly(dG-dC)2 (see Figure 85).Die Selbstassemblierung von Molekülen, die auf π-π-Wechselwirkungen und Wasenstoffbrücken-bindungen basiert, ist von entscheidender Bedeutung in der Natur. Selbstassemblierungsprozesse ermöglichen den Aufbau von komplexen supramolekularen Strukturen mit vielfältigen Funktio-nen. Um Konzepte aus der Natur für künstliche supramolekulare Systeme nutzen zu können, müs-sen die wesentlichen Abläufe der Selbstassemblierungsprozesse verstanden werden. Dazu eignen sich π-konjugierte aromatische Moleküle, die einen relativ einfachen synthetischen Zugang bieten und vielfältig funktionalisiert werden können. Perylenbisimid-Farbstoffe (PBI) stellen für diesen Zweck eine attraktive Substanzklasse dar, da sie aufgrund von großen aromatischen π-Flächen zur Selbstassemblierung tendieren. Zusätzlich können durch die Selbstassemblierung einhergehenden Änderungen der optischen Eigenschaften (beispielsweise Absorption, Emission oder Circulardich-roismus) von PBI-Farbstoffen einfach experimentell studiert werden. Die vielen strukturellen Va-riationsmöglichkeiten von PBI-Farbstoffen erlauben das Einbeziehen von weiteren nichtkovalen-ten Wechselwirkungen zwischen den Molekülen, beispielsweise Wasserstoffbrückenbindungen, sodass der Selbstassemblierungsprozess dirigiert werden kann. Mit diesem Ansatz gelang es bis-her interessante supramolekulare Strukturen von PBI-Farbstoffen aufzubauen, allerdings waren diese oft von undefinierter Größe. Daher war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung von Kon-zepten um die Aggregatgröße von PBI-Farbstoffen zu begrenzen. Hierzu wurden definierte Strukturmerkmale von PBI Molekülen kombiniert, der äußere Einfluss wie Lösungsmittel und Konzentration variiert und DNA als Templat für die größenlimitierte Aggregatstruktur der PBI-Farbstoffe eingesetzt. Die Kapitel 1 und 2 geben allgemeine Informationen und diskutieren Beispiele aus der Literatur, die nötig sind, um die nachfolgend diskutierten experimentellen Arbeiten zu verstehen. Das erste Kapitel diskutiert die Wechselwirkungen verschiedener Molekülen mit DNA. Hierbei wird DNA als ein supramolekulares Biomakromolekül betrachtet und seine spezifischen strukturellen und funktionalen Eigenschaften beschrieben, die für die Interaktionen mit kleinen Molekülen aus-schlaggebend sind. Die wichtigsten Interaktionsformen wie elektrostatische Wechselwirkungen mit dem Phosphatrückgrat, Interkalation durch π-π-Wechselwirkungen mit den Basenpaaren und Furchenbindung durch Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waals-Wechselwirkungen werden anhand ausgewählter Beispiele diskutiert. Von der Vielzahl möglicher Techniken, die angewendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Liganden und DNA zu untersuchen, wer-den UV/Vis-, Fluoreszenz- und Circulardichroismus-Spektroskopie in Detail erläutert. Am Ende des Kapitels werden Beispiele von Wechselwirkungen von bereits prä-assoziierten supramolekula-ren Systemen mit DNA vorgestellt. Das zweite Kapitel beschäftigt sich mit der Bestimmung und mathematischen Beschreibung von Selbstassemblierungsprozessen. Die einfachsten Modelle, wie das Monomer-Dimer und das iso-desmische Modell, werden beschrieben und mit Beispielen ergänzt. Des Weiteren wird die ein-fachste Modifikation des isodesmischen Modells, das K2-K Modell vorgestellt. Anschließend wird auf experimentelle Probleme eingegangen, die bei der Untersuchung von Selbstassemblie-rungsprozessen auftreten können. Um den Assemblierungsprozess vollständig beschreiben zu können, wird ein ausreichend großer Konzentrationsbereich und eine entsprechende Messtechnik, die für diesen Konzentrationsbereich empfindlich genug ist, benötigt. Des Weiteren sollte der vollständige Übergang vom Monomer zum assemblierten System spektroskopisch erfassbar sein. Dies ermöglicht eine akkurate mathematische Auswertung des Selbstassemblierungsprozesses und liefert sinnvolle Bindungskonstanten. Der Selbstassemblierungspfad kann oft durch Variation des Lösungsmittels, Konzentration und Temperatur kontrolliert werden. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, den Selbstassemblierungspfad mit Hilfe eines spezifischen Designs der molekularen Struktur von dem untersuchten System zu dirigieren. Es konnte gezeigt werden, dass ein beson-deres Zusammenspiel von π-π-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen sowohl zum isodesmischen als auch kooperativen Wachstum von großen Strukturen führen kann. Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt in der Entwicklung von Strategien für die Kontrolle der Aggregatgröße von PBI Farbstoffen. (Kapitel 3). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein PBI Gerüst entworfen, das Amidfunktionen in den Imidpositionen für die Ausbildung von Wasser-stoffbrückenbindungen enthält, die von der Aminosäure L-Alanin abgeleitet wurden. Zusätzlich wurden in der Peripherie des Farbstoffgerüsts jeweils löslichkeitsfördernde Seitengruppen R/R‘ wie Didodecyloxyphenyl, Didodecylphenyl, Dioligo(ethyleneglykol)phenyl sowie verzweigte oder lineare Alkylketten eingeführt (siehe Abbildung 81). Der PBI-Farbstoff 5 wurde ausführlich im Hinblick auf sein Aggregationsverhalten untersucht. Konzentrationsabhängige 1H NMR- und UV/Vis Absorptionsmessungen haben klar gezeigt, dass im Lösungsmittel Chloroform dimere Strukturen ausgebildet werden. Begleitende Untersuchungen (2D NMR, VPO und ITC) bestätigten die ausschließliche Präsenz von Dimeren von 5 im experimentell zugänglichen Konzentrationsbereich. Molekulare Modellie-rungs-Studien, die durch NMR und FT-IR Untersuchungen unterstützt werden, illustrieren sehr gut die Ursachen für das Ausbleiben einer weiteren Aggregation zu größeren Strukturen. Die be-sondere Kombination aus den π-π-Wechselwirkungen und den Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den NH-Gruppen der Amidfunktionen und den Carbonylsauerstoffen des PBI-Kerns sind demzufolge entscheidend für die Bildung des diskreten Dimer-Stapels (siehe Abbildung 82). Die Untersuchungen zum Aggregationsverhalten der PBI-Farbstoffe 6-9 waren weniger ausführ-lich, stehen aber im Einklang mit den für PBI 5 gefundenen Ergebnissen. Die ermittelten Bin-dungskonstanten variieren jedoch über einen beachtlichen Bereich von 1.1 x 102 M-1 (PBI 8) bis 1.4 x 104 M-1 (PBI 5). Diese Unterschiede konnten auf strukturelle Variationen der Farbstoffe zurückgeführt werden. Der elektronenreiche Phenylsubstituent förderte die Assemblierungsten-denz von PBIs 5-7 im Vergleich zu 8 und 9, die nur Alkylseitenkennten tragen. Die π-π-Wechselwirkungen der in den Buchpositionen unsubstituierten PBI-Kerne in Kombination mit wasserstoffbrückenbildenden Amidfunktionen steuern somit die Ausbildung diskreter Dimere dieser PBI-Farbstoffe. Durch die Variation der Bedingungen, beispielsweise des Lösungsmittels, ändert sich das Aggre-gationsverhalten der PBI-Farbstoffe. In den Lösungsmitteln Toluol und/oder Methylcyclohexan wurde für das PBI 5 anti-kooperatives Wachstum zu größeren Aggregaten beobachtet (Kapitel 4). Das entscheidende Merkmal dieses Selbstassemblierungsprozesses ist das Fehlen von isosbesti-schen Punkten über den kompletten Konzentrationsbereich in den UV/Vis Absorptionsmessun-gen. Die Bevorzugung der dimeren Struktur von PBI 5 blieb in beiden Lösungsmitteln bzw. de-ren Mischungen erhalten, allerdings assemblierten diese Dimere durch den Anstieg der Konzent-ration in größere Aggregate. Ein wichtiger Schritt im Selbstassemblierungsprozesses ist die bevor-zugte Bildung von geradzahligen Aggregaten gegenüber den ungeradzahligen Aggregaten (siehe Abbildung 83). Das konventionelle K2-K Modell liefert zwar plausible Bindungskonstanten, kann dieses Aggre-gationsverhalten aber nur ungenügend beschreiben, da hier von kontinuierlicher Größenverteilung ausgegangen wird. Der schrittweise Aggregationsprozess über Dimere, Tetramere, Hexamere usw. wurde daher im Folgenden mit einem neu entwickelten K2-K-Modell für anti-kooperatives supra-molekulares Wachstum analysiert. Durch die globale Analyse von UV/Vis Absorptionsspektren konnte eine sehr gute Übereinstimmung zwischen den experimentellen und den auf das neue K2-K Modell basierenden, simulierten Spektren erhalten werden. Des Weiteren zeigten berechnete UV/Vis Absorptionsspektren eines Dimer- und Aggregatspektrums die wichtigsten strukturellen Unterschiede. Das Absorptionsspektrum des Dimers weist immer noch eine ausgeprägte vibroni-sche Struktur auf, welche im Spektrum des Aggregats verloren geht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wird eine Serie von wasserlöslichen PBI-Farbstoffen be-schrieben, die ein ähnliches durch Aminosäuren funktionalisiertes PBI-Gerüst wie PBIs 5-8 auf-weisen (Kapitel 5). Aufgrund der positiv geladenen Seitenketten, die für die elektrostatische Ab-stoßung zwischen den Molekülen sorgen, aggregieren diese Farbstoffe in Wasser zu ähnlichen Dimerstrukturen (siehe Abbildung 84). Hier wurde allerdings das Selbstassemblierungsverhalten in Wasser aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu bereits publizierten PBI-Farbstoffen nicht eingehend untersucht. Stattdessen lag der Fokus hier auf der Charakterisierung der Wechselwirkungen dieser Farbstoffe mit DNA/RNA. Die umfassenden Studien mit Hilfe von thermischen Denaturierungsstudien zeigten eine hohe Stabilität der PBI/Polynukleotid-Komplexe. Die Spermin-funktionalisierten PBI-Farbstoffe, welche sechs positive Ladungen aufweisen, zeigten starke Wechselwirkungen mit DNA/RNA, was sich durch deutliche Schmelzpunkterhöhung der DNA/RNA (ΔTm-Werte zwischen 7 und > 35 °C) äußerte. Die analogen Dioxa-Verbindungen mit nur zwei positiven La-dungen wiesen geringere Schmelztemperaturerhöhungen der jeweiligen DNA/RNA (ΔTm-Werte zwischen 3 und 30 °C) auf. Dieser Trend wurde auch in den fluorimetrischen Titrationsstudien beobachtet. Die Spermin-funktionalisierten PBI-Farbstoffe zeigten hohe Bindungskostanten (log Ks = 9.2 – 9.8), unabhängig von den verwendeten Polynukleotiden. Im Gegensatz dazu wie-sen die Dioxa-Analoge kleinere Bindungskonstanten (log Ks = 6.5 – 7.9) auf, wobei kein Zusam-menhang zwischen Bindungsaffinität und Bindungsstärke zwischen den PBI-Molekülen und den verwendeten Polynukleotiden hergestellt werden konnte. Die CD-spektroskopischen Messungen verdeutlichten die signifikanten Unterschiede in den Bindungseigenschaften der Farbstoffe mit DNA/RNA. Entscheidend waren die sterische Hinderung der Aminosäurereste in den Imidposi-tion und deren Konfiguration auf der einen Seite und die Furcheneigenschaften von ds-DNA/RNA auf der anderen Seite. Die spektroskopischen Ergebnisse belegten die Bildung von exzitonisch gekoppelten PBI-Dimeren in der kleinen Furche von ds-DNA und der großen Furche von ds-RNA. Die Furchen der Polynukleotide bieten unterschiedlich viel Raum für das Einbetten von Molekülen, was von der jeweiligen Sequenz abhängt. Die Guanin-Aminogruppen ragen in die kleine Furche des Polynukleotids poly(dG-dC)2, wodurch die sterische Hinderung im Vergleich mit dem Polynukleotid poly(dA-dT)2 zunimmt. Molekulare Modellierungsstudien belegten, dass die PBI-Dimere tiefer in die Furche von poly(dA-dT)2, als in die Furche von poly(dG-dC)2 einge-schlossen werden, was auf die eben genannte sterische Hinderung zurückgeführt werden kann (siehe Abbildung 85)