The role of Protein Kinase B (Akt) in the cellular response to ionizing radiation

Tumorassoziierte Mutationen in Proteinen des PI3K/Akt-Signalweges, einschließlich Mutationen von Akt1, können in einer Hyperaktvierung dieser Überlebenskinase resultieren, die häufig mit einer Resistenz gegenüber genotoxischen Therapien verbunden ist. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten COSMIC-Datenbankanalyse wurde das Auftreten von Mutationen in Akt1 und anderen PI3K-Signalwegskomponenten in verschiedenen Tumortypen bestätigt und auch eine der Literatur entsprechende Verteilung gefunden. Insbesondere bestätigten diese Analysen frühere Beobachtungen zur klinischen Relevanz der Aminosäuresubstitution in Akt1 von Glutaminsäure (Position 17) zu einem Lysin (E17K) in Brust-, Blasen-, Lungen-, Prostata- und kolorektalem Krebs. Dies macht Akt zu einem wichtigen therapeutischen Angriffspunkt in der Tumortherapie. Obwohl in den letzten Jahren viele Fortschritte zum Verständnis der Regulation und Funktionalität von Akt gewonnen wurden, ist dessen Rolle für die Strahlensensitivität und der Reparatur strahleninduzierter DNA-Schäden unzureichend verstanden. Ziel dieser Arbeit war daher die Ergründung der Effekte von Akt1 auf die zelluläre Strahlenantwort. Hierzu wurden murine Prostatakarzinomzellen und murine embryonale Fibroblasten mit Überexpression verschiedener Akt1-eGFP-Fusionsproteine generiert, die sich in ihrer PIP3-Bindeeigenschaft und Aktivität unterschieden. Mit Hilfe dieser Zellen konnte gezeigt werden, dass die aktivierungsassoziierten Akt1-E17K und myrAkt1-Varianten mit verstärkter Lokalisation an der Zytoplasmamembran eine verstärkte Zellproliferation aufweisen. Akt1-defiziente MEFs zeigten nach Überexpression von Akt1-E17K ein verstärktes Tumorwachstum in vivo, was auf eine transformierende Aktivität dieser klinisch relevanten Akt-Veränderung hindeutet. In Kurzzeit- und Langzeitexperimenten zum Zellüberleben nach Bestrahlung zeigten die membranaktivierte Akt1-E17K Mutation und die Phosphorylierungs-imitierende Akt1-TDSD eine erhöhte Resistenz gegen ionisierende Strahlung, während myrAkt1 Zellen durch eine erhöhte Radiosensitivität charakterisiert waren. Untersuchungen zur Kinetik der DNA-Reparatur mittels γ-H2.AX-Assay sowie einem direkten DNA-Schaden-Assay nach Bestrahlung, zeigten eine verlangsamte Reparatur strahlungsinduzierter DNA-Schäden in den myrAkt1-exprimierende Zellen, wogegen die Mutationen TDSD und E17K die Reparatur im zeitlichen Verlauf zwischen 2 - 4 h beschleunigten. Dies deutete darauf hin, dass eine direkte Beschleunigung der DNA-Reparatur zur erhöhten Radioresistenz von Akt1-E17K- und Akt1-TDSD-überexprimierenden Zellen beiträgt. Interessanterweise zeigten Lokalisationsstudien, dass myrAkt1 an Membranstrukturen akkumuliert und weder vor noch nach Bestrahlung in den Zellkern transloziert. Akt1-E17K zeigte eine ausgeprägte Membran-Lokalisation; nach Bestrahlung war aber eine vermehrte Kerntranslokation zu beobachten. Akt1-TDSD hingegen zeigte keine verstärkte Membranbindung, sondern war durchgehend zu einem hohen Anteil im Kern zu finden. Der Zusammenhang von erhöhter Kernlokalisation und Radioresistenz lässt vermuten, dass die Anwesenheit von aktivem Akt1 im Nukleus für eine Veränderung der Radiosensitivität notwendig ist. Tatsächlich konnten die Radioresistenz-fördernden Effekte von Akt1-E17K und Akt1-TDSD sowohl durch Vorbehandlung mit einem allosterischen (MK-2206) als auch mit einem kompetitiven Akt-Inhibitor (GDC0068) gehemmt werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass beide Inhibitoren auch den beschleunigenden Effekt dieser Akt1-Varianten auf die DNA-Reparatur antagonisieren. Dies ließ vermuten, dass die Radioresistenz-fördernden Effekte der aktivierungsassoziierten Akt1-Varianten durch Effekte auf die DNA-Reparatur bedingt waren. Auch die Vorbehandlung mit dem DNA-PK-Inhibitor NU7441 hatte einen Verlust der positiven Wirkung von Akt1-E17K und Akt1-TDSD auf das Zellüberleben und die DNA-Reparatur nach einer Bestrahlung zur Folge. Dies wies auf eine Beteiligung von aktivem, im Kern lokalisierten Akt1 an dem DNA-PKcs-abhängigen DNA-Reparaturweg D-NHEJ hin. Um die Hierarchie der Phosphorylierung der Kinasen DNA-PKcs und Akt1 zu ergründen, wurde ein Kinase-Assay mit diesen beiden Proteinen etabliert. Dabei stellte sich heraus, dass Akt1 direkt durch DNA-PK am Serin 473 phosphoryliert werden kann. Allerdings gab es keine direkte Phosphorylierung von DNA-PK durch aktives Akt1. Diese Ergebnisse bestätigten die in silico Analysen zu Konsensussequenzen und deuten auf eine indirekte Beteiligung von Akt1 bei der DNA-Reparatur mittels D-NHEJ hin. Beispielsweise ist ein Feedback-Mechanismus denkbar, in dem Akt1 nach strahleninduzierter DNA-Schädigung durch DNA-PKcs aktiviert wird und daraufhin potenziell an der DNA-Reparatur-beteiligte Proteine phosphoryliert, um so die Dynamik der Reparatur zu beeinflussen. Darüber hinaus wird so eine Verbindung von Initiation der DNA-Reparatur, Zellzyklus-Arrest und Apoptose-Hemmung hergestellt. Aus den erzielten Ergebnissen der vorliegenden Arbeit zur Radioresistenz-steigernden Wirkung von E17K kann geschlussfolgert werden, dass diese Mutation einen potentiellen Biomarker für erhöhte Resistenz gegenüber einer Bestrahlung und anderen DNA-schädigenden Therapien darstellt und die betroffenen Patienten somit von einer Intensivierung der genotoxischen Therapie oder einer Kombinationstherapie mit Akt-Inhibitoren profitieren könnten. Dies gilt analog für Patienten mit einer aberranten Erhöhung der Akt1-Aktivität als Folge einer Mutation in PIC3A oder PTEN. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden folgende Publikationen mit Teilergebnissen veröffentlicht: 1 Oeck S, Malewicz NM, Hurst S, Rudner J, Jendrossek V. The Focinator - a new open-source tool for high-throughput foci evaluation of DNA damage. Radiat Oncol 2015;10(163):015-0453. 2 Weisner J, Gontla R, van der Westhuizen L, Oeck S et al. Covalent-Allosteric Kinase Inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl 2015;54(35):10313-10316.Tumor-associated mutations of proteins of the PI3K/Akt pathway, including mutations of Akt1, may result in a hyper activation of this survival kinase. It can be associated with resistance to genotoxic therapies. A COSMIC database analysis, conducted in this project, highlights the incidence of mutations in Akt1 and other PI3K/Akt pathway components in various types of tumors. In particular, this analysis confirmed earlier observations on the clinical relevance of the amino acid substitution in Akt1 of glutamic acid (position 17) to a lysine (E17K) in breast, bladder, lung, prostate and colorectal cancer. This makes Akt an important therapeutic target in tumor therapy. Progress has been made in understanding of regulation and functionality of Akt, but its role in radiosensitivity and repair of radiation-induced DNA damage is still poorly understood. The aim of this project was the exploration of effects of Akt1 in the cellular radiation response. For these investigations murine prostate carcinoma cells and murine embryonic fibroblasts overexpressing different Akt1-eGFP fusion proteins, differing in their PIP3-binding property and activity, were generated. The activation-associated Akt1-E17K and myrAkt1 variants with enhanced localization to the cytoplasmic membrane had enhanced cell proliferation. Akt1-deficient MEFs overexpressing Akt1-E17K showed an enhanced tumor growth in vivo, suggesting a transforming activity of this clinically relevant Akt mutation. In short- and long-term cell survival experiments after irradiation, the membrane-activated Akt1-E17K mutation and the phosphorylation-mimicking Akt1-TDSD had an increased resistance to ionizing radiation in contrast to myrAkt1 expressing cells with an increased radiosensitivity. DNA repair studies by γ-H2.AX assay, as well as direct DNA damage assay after irradiation presented a reduced repair of radiation-induced DNA damage in the myrAkt1-expressing cells. Though, the mutations TDSD and E17K had accelerated DNA repair between 2 and 4 hour. This indicated that an acceleration of DNA repair contributes to increased radioresistance of Akt1-E17K and Akt1-TDSD overexpressing cells. Interestingly, localization studies revealed accumulation of myrAkt1 at membrane structures. It did not translocate before or after irradiation into the nucleus. Akt1-E17K showed increased membrane localization after irradiation. However, an increased nuclear translocation was observed. In contrast, Akt1-TDSD showed no enhanced membrane binding, but was found in a high proportion in the nucleus. The relationship between increased nuclear localization and radioresistance suggests that the presence of active Akt1 in the nucleus is necessary for a change in radiosensitivity. In fact, radioresistance-promoting effects of Akt1-E17K and Akt1-TDSD were inhibited by pretreatment with an allosteric (MK-2206) as well as a competitive Akt inhibitor (GDC0068). Both inhibitors antagonized the accelerating effect on the kinetics of DNA repair of these Akt variants expressing cells. These results that the radioresistance-promoting effects of activation associated Akt1 variants are based on direct effects on DNA repair. Likewise the pretreatment with the DNA-PK inhibitor NU7441 resulted in a loss of the positive effect of Akt1-E17K and Akt1-TDSD on cell survival and DNA repair after a radiation exposure. The participation of active, nucleus localized Akt1 on the DNA-PKcs-dependent DNA repair pathway D-NHEJ. To explore the hierarchy of phosphorylation of the kinases DNA-PKcs and Akt1, a kinase assay was established. It was found that Akt1 can be phosphorylated directly by DNA-PKcs at serine 473. However, there was no direct phosphorylation of DNA-PKcs via active Akt1. These results confirmed the in silico analysis of consensus sequences and suggest an indirect interaction of Akt1 in the DNA repair by D-NHEJ. For example, a feedback mechanism is conceivable, that is activated after radiation-induced DNA damage by Akt1’s phosphorylation via DNA-PKcs. Activated Akt1 could potentially phosphorylate DNA repair-involved proteins in order to influence the dynamics of repair. In addition, as a compound of initiation of DNA repair, cell cycle arrest and apoptosis inhibition is initiated. Concluding from these results E17K mutation is a potential biomarker for increased resistance to radiation and other DNA-damaging therapies. Patients with tumors carrying this mutation could benefit from Akt inhibitors in combination with genotoxic therapy. Patients with aberrant increased Akt activity as a result of a mutation in PTEN or PIC3A could also profit from this combination therapy