Study of expression of transferrin receptors (TfR1) and their utilization in nanomedicine

Bakalářská práce se zabývá studiem exprese transferinového receptoru (TfR1) a jeho využitím v nanomedicíně. Během posledního desetiletí se nanotechnologie zařadily mezi centrální milníky při spojování všech vědeckých a technických disciplín. Nanoléčba již prokázala účinnost nejen u zvířecích modelů nádorových onemocnění, ale také v klinické praxi. V teoretické části je pojednáno nejen o nádorových onemocněních lidské populace, ale i o možnostech cílené dopravy nanoléčiva k nádorové tkáni, což značně snižuje jinak vážné vedlejší účinky konvenční léčby – systémovou toxicitu. V praktické části jsou optimalizovány podmínky pro studium exprese transferinového receptoru, což je protein, který ve zvýšené míře exprimují neoplastické buňky za cílem uspokojení svých vyšších metabolických potřeb. Jako optimální byly pro detekci exprese transferinového receptoru u různých buněčných linií zvoleny následující podmínky: lyzát z 50 000 buněk nanášený do jamky gelu v neredukujícím nedenaturačním pufru, 1,0 g/ml primární protilátky. Byla zjištěna různá míra exprese v závislosti na typu buněk, přičemž byly vybrány buněčné linie neuroblastomu, nádoru prostaty (riziko výskytu u každého 7. muže) a karcinomu prsu (riziko výskytu u každé 8. ženy ve vyspělých zemích). Na transferinový receptor lze navázat apoferritin, což je protein, který v těle běžně slouží pro skladování iontů železa. Uměle však lze jeho vnitřní dutinu využít pro přepravu jakékoli molekuly, v případě této bakalářské práce se jednalo o doxorubicin. Právě doxorubicin je používán pro léčbu nádorových onemocnění již více než 30 let, nicméně terapeutická dávka je limitována jeho vysokou toxicitou. Tu lze snížit enkapsulováním cytostatika do vhodného přenašeče pro cílenou dopravu pouze k nádorovým buňkám. V práci bylo potvrzeno, že využití apoferritinu jako nanotransportéru pro přenos chemoterapeutika je vhodné díky velikosti molekul 10-12 nm, která umožňuje využití efektu zvýšené permeability a retence; zároveň jim tato velikost umožňuje vyhnout se renální clearance. Vlastnosti enkapsulovaného doxorubicinu nejsou apoferritinem nijak ovlivněny a zachovává si tak svoji toxicitu pro buňky s vysokou mírou exprese TfR1 (30%inhibice růstu těchto buněk po 24 hod léčby).Bachelor thesis deals with the expression of the transferrin receptor (TfR1) and its use in nanomedicine. During the last decade, nanotechnology emerged as one of the central milestones in connecting all scientific and technological disciplines. Nanomedicine already demonstrated efficacy not only in animal models of cancer but also in clinical practice. The theoretical part is not only aimed at cancer of the human population, but also at the possibilities of targeted drug delivery into the tumor tissue, which greatly reduces the otherwise serious side effects of conventional treatment – systemic toxicity. The practical part is focused on optimization for studying the expression of the transferrin receptor, a protein overexpressed by neoplastic cells aiming to enrich the higher metabolic needs of tumor cells. The optimal conditions were as follows: lysate of 50 000 cells applied with nonreducing nondenaturing buffer and the concentration of the primary antibody of 1.0 𝜇g/ml. Different levels of TfR1 expression were detected, depending on the type of tumor cells. The cell lines of neuroblastoma, prostate cancer (occurence in every 7th man) and breast cancer (occurence in every 8th woman) were selected for the next experiments. Via this transferrin receptor, apoferritin, which is a protein storaging iron ions in many organisms, can be internalized into cells. Artificially, the internal cavity of apoferritin may be used for encapsulation and transport of any molecules. In the case of this bachelor thesis, the apoferritin was used for delivery of doxorubicin. Doxorubicin has been used for cancer treatment for more than 30 years; however, its administered dose is limited by its high toxicity. This can be reduced by its encapsulation in a suitable vector for targeted transport to the tumor cells only. Apoferritin could serve as such suitable vector. In this thesis, the suitable usage of apoferritin as a nanocarrier for chemotherapeutic delivery was confirmed. Its molecule size of 10-12 nm allows it to employ the effect of increased permeability and retention. At the same time, this size makes it possible to avoid renal clearance. The properties of encapsulated doxorubicin are not affected by apoferritin, thus preserving its toxicity for cells with a high level of TfR1 expression (30% growth inhibition of these cells after 24 h of treatment).