Biotyping of ascomycetous yeasts

Pro biotypizaci MALDI-TOF bylo vybráno celkem 84 izolátů kvasinek například z vody, rostlin, ovocných plodů nebo půdy. Veškeré kmeny byly kultivovány na sladinovém agaru a YPD médiu. Vzorky pro biotypizaci byly upraveny podle metody firmy Bruker Daltonik GmbH, Chemického ústavu SAV a kombinací obou těchto metod. Jednotlivé kmeny byly identifikovány na základě analýzy intracelulárních ribozomálních proteinů hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF. V případě nejednoznačnosti výsledků byla u daných kmenů vyizolována DNA a sekvenována doména D1/D2 26S rRNA. Identifikace kmenů byla provedena srovnáním jejich hmotnostních spekter se spektry sekvenovaných kmenů v programu MALDI Biotyper 3.0. Výsledkem byly hodnoty skóre, na jejichž základě byla posouzena vzájemná podobnost kmenů. Z celkového počtu 84 kmenů, jich 18 bylo předem sekvenováno a sloužily tak jako vzorové kmeny pro porovnání s neznámými izoláty. Dohromady 51 kmenů bylo jednoznačně taxonomicky zařazeno do 18 fylogenetických skupin na úrovni druhu. Pro celkem 6 kmenů byla biotypizace hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF opakována z důvodu nejednoznačnosti výsledků. U 15 kmenů nebylo taxonomické zařazení jasně určeno, a proto byly navrženy na sekvenaci domény D1/D2 26S rRNA. Pouze jeden kmen z celkového množství nebylo možné na základě sekvenování identifikovat, a proto byla izolace DNA opakována. V případě 8 kmenů byly výsledky sekvenování shodné s původně navrženým taxonomickým zařazením. Naopak zbylých 6 kmenů bylo identifikováno jako jiný druh. U 20 vybraných kmenů byly stanoveny základní charakteristiky pomocí mikrobiologických metod. Byl pozorován vzhled kolonií na tuhém médiu a také vzhled kultur v tekutém médiu. Dále pak byla stanovena konstanta radiálního růstu a přítomnost ureázy. V neposlední řadě bylo provedeno mikroskopické pozorování buněk a kvasná zkouška na sacharidových médiích.In total, 84 yeast strains (originated from water, plants, fruits and soil) were selected for MALDI-TOF biotyping. All strains were cultivated on malt agar and YPD medium. Samples for biotyping were processed according to methods of Bruker Daltonik GmbH company, Institute of Chemistry of SAS and combination of these methods. Single strains were identified based on the analysis of intracellular ribozomal proteins using MALDI-TOF mass spectrometry. In case of ambiguous results, the DNA was isolated and the D1/D2 26S rRNA domain sequencing was performed. The strain identification was carried out by comparing its mass spectra with spectra of sequenced strains using MALDI Biotyper 3.0 software. The mutual similarity of strains was considered by score value, which was the result of the analysis. In total, 18 strains from 84 were previously sequenced and used as model strains for comparison with unknown isolates. Altogether 51 strains were definitely taxonomically categorized into 18 phylogenetic groups at the species level. The MALDI-TOF biotyping was repeated for overall 6 strains because of ambiguity of results. The taxonomic classification of 15 strains was not clearly determined and, therefore, these strains were suggested for D1/D2 26S rRNA domain sequencing. It was not possible to identify one strain, based on the results of sequencing, therefore, the DNA isolation was repeated. In the case of 8 strains, the results were identical with originally designed taxonomic classification. Conversely, the remaining 6 strains were identified as species. For 20 selected strains the basic characteristics were determined using microbiological methods. The shape of colonies growing on solid medium and appearance of cultures in liquid medium was assessed. Furthermore, the radial growth constant and the presence of urease were determined. Finally the microscopic observation of cells and the fermentation test for carbohydrate substrates were performed.