O uso de Imposex/Intersex como ferramenta para avaliar a qualidade do estado ecológico de massas de água

Doutoramento em BiologiaA Directiva Quadro da Água (DQA) foi introduzida pela União Europeia (UE) em 2000 com o objetivo de proteger as águas de superfície (interiores, de transição e costeiras) e subterrâneas. Esta ambiciosa directiva lançou novos desafios, entre os quais a necessidade de desenvolver novas ferramentas ecotoxicológicas para a avaliação do estado ecológico das massas de água. O tributilestanho (TBT), um biocida amplamente utilizado em tintas antiincrustantes e identificado como agente causador do fenómeno de imposex / intersex em gastrópodes, está incluído na lista de substâncias prioritárias da DQA. No entanto, esta directiva não considera qualquer ferramenta de biomonitorização específica para avaliar os efeitos nocivos do TBT nos ecossistemas. O único objetivo concreto para esta substância é referido nas Normas de Qualidade Ambiental (NQA) e atingido a 0,2 ng TBT / L (NQA - Média Anual). Mais tarde, em 2008, a Directiva Quadro da Estratégia Marinha (DQEM) foi introduzida na UE com objectivos semelhantes à DQA, mas direcionada para águas marinhas. No entanto, uma vez mais, não foi proposta nenhuma ferramenta ecotoxicológica para a monitorização dos efeitos biológicos provocados por este poluente. Assim, de forma a integrar a biomonitorização da poluição por TBT ao abrigo destas directivas, esta tese tem como objetivo desenvolver e testar, sob diferentes cenários, ferramentas baseadas nos biomarcadores imposex/intersex para avaliar o estado ecológico de massas de água. Assim, é proposto um sistema de classificação baseado nos níveis de imposex/intersex de populações de gastrópodes para avaliar o estado ecológico de águas costeiras e de transição, relativamente à poluição por TBT. Utilizando a Ria de Aveiro (NW Portugal) como estudo de caso, três bioindicadores - os gastrópodes Nucella lapillus, Nassarius reticulatus e Littorina littorea - foram utilizados tendo em conta o elemento de qualidade biológica para invertebrados bentónicos da DQA, de forma a classificar o estado das massas de água desta região. O índice de sequência do vaso deferente (VDSI) e o índice de intersex (ISI) foram os parâmetros de imposex/intersex selecionados para avaliar o estado ecológico, relativamente à poluição por TBT. Os limites definidos pelos Rácios de Qualidade Ecológica (EQR) foram obtidos para cada espécie, a fim de definir as cinco classes de estado ecológico (Excelente, Bom, Razoável, Medíocre e Mau). A espécie N. lapillus é proposta como bioindicador chave na monitorização da poluição por TBT, no entanto, o uso combinado das outras espécies revela-se muito útil porque permite monitorizar uma área maior e uma maior diversidade de habitats. Esta ferramenta de monitorização multiespecífica demonstrou ser bastante útil para avaliar a evolução temporal do estado ecológico das massas de água da Ria de Aveiro entre 1998 e 2013, que demonstrou uma clara melhoria, alcançando um bom estado ecológico em 2013. Este trabalho propõe também uma outra ferramenta destinada a avaliar a qualidade dos sedimentos. Esta ferramenta consiste num bioensaio em que se expõem fêmeas de N. reticulatus a sedimentos recolhidos no ambiente para determinar se ocorre um aumento de imposex. Este bioensaio provou ser uma ferramenta complementar e com relevância ecológica na monitorização da poluição por TBT na medida em que fornece informação sobre a fracção biodisponível de TBT nos sedimentos e permite avaliar locais onde não existem bioindicadores disponíveis. Para testar o uso de ambas ferramentas em programas de monitorização da DQA, estas foram aplicadas em dois sistemas estuarinos - Minho e Lima - localizados no Norte de Portugal. A monitorização de imposex evidenciou um bom estado ecológico no Minho mas o estuário do Lima não conseguiu alcançar o objetivo de bom estado ecológico, apresentando locais com um estado "moderado" ou de qualidade inferior. Em conformidade, o bioensaio com sedimentos confirmou a presença de TBT biodisponível apenas nos sedimentos do estuário do Lima, já que se observou o aumento de alguns parâmetros de imposex com estes sedimentos. O uso combinado destas ferramentas permitiu aumentar a área de monitorização nestes sistemas estuarinos, uma vez que não foi possível encontrar bioindicadores em todas as estações de amostragem, sendo nesse caso obtidas apenas amostras de sedimento. O critério proposto para a monitorização de imposex na DQA foi também testado ao longo da costa portuguesa de forma a avaliar a evolução do estado ecológico de 2000 a 2014. Em 2014, as fêmeas de N. lapillus colhidas em praias ao longo da costa exibiram baixos níveis de imposex, exceto numa estação situada na Zambujeira do Mar (SW Portugal) onde foram encontradas fêmeas estéreis. Já as fêmeas de N. reticulatus mostraram baixos níveis de imposex na maioria das estações amostradas, porém elevados níveis foram observados em áreas sujeitas a um intenso tráfego naval. Comparando estes valores com os observados em anos anteriores, é possível perceber que ambas as espécies recuperaram de forma significativa ao longo dos últimos 15 anos. N. lapillus apresentou uma redução dos níveis de imposex mais pronunciada do que N. reticulatus, porém esta diminuição parece ter abrandado nos últimos anos (2011-2014), prevendo-se uma estabilização por algum tempo em níveis muito baixos. N. reticulatus também mostrou uma diminuição gradual, mas os valores de imposex indicam uma recuperação mais lenta em portos de pesca e marinas. Isto representa uma mudança das principais fontes de poluição por TBT, já que os níveis de imposex em grandes portos comerciais, outrora locais altamente poluídos, caíram rapidamente. Assim, na costa Portuguesa, o bom estado ecológico foi alcançado na maior parte das estações localizadas em águas costeiras, no entanto uma qualidade ecológica inferior foi observada em massas de água de transição, especialmente onde estão localizados portos de pesca e marinas. A classificação da qualidade ecológica da costa portuguesa segundo a DQA (proposta apresentada nesta tese) e a OSPAR, relativamente à poluição por TBT, é analisada no presente trabalho. Esta comparação é da maior importância, pois tanto as premissas da DQA, como as ferramentas de monitorização utilizadas pelas convenções regionais marinhas (por exemplo a OSPAR) devem ser integradas na aplicação da DQEM. As classificações obtidas segundo a DQA e a OSPAR apresentam um resultado global muito semelhante para 2014, e ambas denotam uma apreciável recuperação do estado ecológico ao longo dos últimos anos. A integração da monitorização de imposex/intersex na DQEM é aqui recomendada e discutida, tendo em conta possíveis divergências nos objetivos definidos por cada legislação e os meios para alcançá-los. Mesmo que a utilidade das ferramentas empregadas para monitorizar a poluição por TBT tenham sido comprovadas, a monitorização de imposex/intersex a ser aplicada na DQA e DQEM só será eficaz se: (i) houver uma boa escolha de bioindicadores; (ii) o imposex/intersex constituírem uma resposta específica para a poluição por TBT porque se outros contaminantes tiverem a capacidade de induzir imposex ou intersex, estes biomarcadores perdem grande parte do seu valor operacional. Por estas razões, esta tese apresenta ainda alguns resultados que devem ser considerados para a validação da utilização do imposex/intersex na monitorização da poluição por TBT. A Ria de Aveiro é uma área que tem sido intensamente estudada em relação à poluição por TBT e, conforme descrito anteriormente, apresentou uma importante melhoria do estado ecológico em relação a este poluente prioritário. No entanto, uma tendência contrária foi observada na evolução dos níveis de imposex no gastrópode Peringia ulvae. Esta espécie - considerada por vários autores como um bom bioindicador da poluição por TBT - não demonstrou uma recuperação dos níveis de imposex, apesar dos níveis de TBT e de imposex/intersex noutras espécies terem vindo consistentemente a diminuir nesta área. Em vez disso, houve um aumento global na percentagem de fêmeas afetadas por imposex e nos níveis de VDSI até 2012, sendo que os níveis de imposex em 2015 são ainda semelhantes aos encontrados em 1998. As possíveis razões para o padrão contracorrente observado nesta espécie podem estar relacionados com a interferência de outros factores que influenciam a expressão do imposex; por exemplo, a indução de imposex por parasitas - que são difíceis de controlar quando a monitorização é realizada com esta espécie - pode enviesar a interpretação dos resultados. É, portanto, necessária uma escolha criteriosa dos bioindicadores a utilizar no âmbito das directivas DQA e DQEM. O imposex não é apenas um efeito exclusivo do TBT, uma vez que já foi descrito que o trifenilestanho (TPT) pode também causar este fenómeno em algumas espécies de gastrópodes. Aqui, é descrita, pela primeira vez, a indução de imposex por TPT em N. lapillus, a espécie que foi proposta como bioindicador chave na DQA. Curiosamente, o desenvolvimento do imposex em fêmeas de N. lapillus injetadas com TPT é diferente das injectadas com TBT, uma vez que as primeiras desenvolvem uma via de imposex principalmente afálica (sem desenvolvimento do pénis). Estes resultados sugerem que o TPT e o TBT podem agir de forma diferente no processo de masculinização de fêmeas de gastrópodes, lançando novas perspectivas sobre as hipotéticas vias subjacentes ao desenvolvimento de imposex. É importante saber se existem outros contaminantes, para além dos organoestânicos, capazes de induzir (ou interferir com) o desenvolvimento de imposex ou intersex, com vista à validação das ferramentas de monitorização propostas nesta tese. Para tal, um ensaio com um gene repórter foi realizado em células transfectadas com recetores humanos, cujos ortólogos foram anteriormente identificados em gastrópodes (RXR, PPAR, ER e RAR). Sabendo que o imposex é causado pela ativação dos recetores nucleares RXR e PPARy por parte do TBT e TPT, é importante perceber se outros contaminantes são capazes de ativar estes recetores. Testaram-se vários contaminantes ambientais e mesmo que algumas substâncias tenham tido a capacidade de ativar ligeiramente o RXR e PPARy, nenhuma foi capaz de o fazer com uma potência semelhante ao TBT e TPT, sugerindo que estas são as únicas substâncias testadas capazes de induzir imposex para concentrações ambientalmente relevantes. Não obstante, todas as substâncias que foram capazes de ativar os recetores foram identificadas e o seu potencial para causar disrupção endócrina nos gastrópodes é discutido. Em conclusão, as ferramentas propostas nesta tese podem ser extremamente úteis na monitorização do ambiente aquático ao abrigo das recentes directivas da União Europeia. Em Portugal existem três peças legislativas que se sobrepõem espacialmente nas águas costeiras (DQA, DQEM e OSPAR) e águas de transição (DQA e OSPAR), e podem diferir nos seus objetivos específicos relativamente à poluição por TBT. Logo, existe uma necessidade urgente de encontrar objetivos comuns na UE, tanto químicos e biológicos, para este poluente. Para além disto, e num momento em que a busca de modelos biológicos não vertebrados está a aumentar em ecotoxicologia, esta tese realça o uso de gastrópodes como uma possível opção. O trabalho desenvolvido nesta tese mostra que a poluição por TBT tem vindo a diminuir em Portugal mas ainda existem alguns locais onde os níveis são altos e não atingem os objectivos definidos pela OSPAR e pela DQA (segundo a proposta aqui apresentada). As ferramentas propostas nesta tese podem ser úteis para acompanhar a evolução da situação em Portugal e na UE nos próximos anos e identificar os locais onde será necessário melhorar a qualidade ecológica das massas de água relativamente a esta substância prioritária, de acordo com as metas estabelecidas pela legislação vigente.The Water Framework Directive (WFD) was introduced in the European Union (EU) in 2000 with the objective to protect the EU surface waters (inland, transitional and coastal) and ground waters. This ambitious directive raised new challenges, as the need to develop quick and low-cost effect-based monitoring tools, which are increasingly being recommended to perform a proper environmental assessment under this directive. Tributyltin (TBT), a biocide largely used in antifouling paints and identified as a causative agent of imposex/intersex in gastropods, is listed as a priority substance in WFD. However, this directive does not consider any particular biomonitoring tool to assess TBT deleterious effects on the ecosystems. The only explicit objective for TBT regards the Environmental Quality Standard (EQS – Annual Average = 0.2 ng TBT/L). Later on, in 2008, the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) was introduced in the EU with similar objectives but specifically related to marine waters that again failed to propose an effect based tool to monitor this pollutant. Therefore, to integrate TBT pollution monitoring within these legislative frameworks, it is the aim of this thesis to develop effect based tools centred on the imposex/intersex biomarkers in order to assess the ecological quality status of EU water bodies regarding TBT pollution. This work proposes a scoring system based on imposex/intersex levels to assess the WFD ecological quality status regarding TBT pollution of transitional and coastal waters. Taking Ria de Aveiro (NW Portugal) as a case study, three bioindicators – the gastropods Nucella lapillus (dog-whelk), Nassarius reticulatus (netted-whelk) and Littorina littorea (periwinkle) - were used under the general WFD benthic invertebrate quality element to classify the ecological status of this area. The vas deferens sequence index (VDSI) and the intersex index (ISI) were selected as biomarkers to assess the condition of this quality element regarding the impact of TBT pollution. EQR boundaries were set for each species in order to define the five ecological status classes (High, Good, Moderate, Poor and Bad). N. lapillus is proposed as a key bioindicator species, however the combined use of further species is very useful to cover a wider monitoring area and a higher diversity of habitats. This multi-species monitoring tool was useful to assess the temporal evolution of the ecological status of Ria de Aveiro water bodies between 1998 and 2013, showing that all the surveyed area improved and reached a good ecological status in 2013. This work also proposes other imposex based tool that allows to evaluate the sediment quality, regarding TBT pollution. The use of this bioassay has proven to be a practical and ecological relevant tool as (i) it can give information for sites with no native populations of snails, (ii) it provides early identification of polluted sites anticipating future imposex levels or early identification of recovering, and (iii) it yields information on the bioavailable fraction of the TBT in the sediment. Therefore, this tool can also be of extreme usefulness under the scope of recent European legislative frameworks. To confirm the suitability of the above mentioned tools in WFD monitoring programs, they were both applied in two estuarine systems - Minho and Lima - located in NW Portugal. The imposex field monitoring evidenced a good ecological status in Minho while the Lima estuary fail to reach the WFD good ecological status objective by presenting sites with “Moderate” and “At Best Poor” ecological status. Accordingly, the sediment bioassay confirmed the presence of bioavailable TBT only in the Lima sediments. The combined use of these tools allowed to increase the monitoring area in these estuarine systems and enhanced the robustness of the assessment, as the bioindicators fail to exist at many sites of the study area. The proposed criteria for imposex monitoring under the WFD was tested along the Portuguese coast to assess the evolution of the ecological status from 2000 to 2014, using N. lapillus and N. reticulatus as bioindicators. Lately, the dogwhelks collected in coastal shores exhibited low imposex levels, except at one station in Zambujeira do Mar (SW Portugal) where sterile females were still found. Accordingly, the netted-whelk showed low levels of imposex at the majority of the sampled stations but high levels were still observed at areas subjected to intense naval traffic. When comparing these data regarding the most recent years with past imposex levels, it is perceived that both species recovered significantly over the last 15 years. N. lapillus presented a more pronounced decrease in imposex levels than N. reticulatus, however this declining trend decelerated from 2011 to 2014. N. reticulatus also showed a gradual decrease but the imposex values indicate a slower recovery at fishing harbours and marinas, which represents an apparent shift in the TBT hotspots as imposex levels in large commercial ports fell rapidly. Consequently, in the Portuguese coast a good ecological status was achieved in most of the stations located in coastal waters while a worse ecological quality was observed in transitional water bodies where fishing ports and marinas are located. A comparison between the proposed WFD imposex tool and the OSPAR Assessment Criteria for imposex shows that both classifications schemes present a general similar result for 2014 and point to a clear recovery of the quality status over the years. This comparison between two legislations is of foremost importance since both WFD premises and Regional Sea Conventions (e.g OSPAR) knowledge and monitoring tools should be integrated by member states on the application of the MSFD. Therefore the imposex/intersex monitoring integration within MSFD is discussed taking into account possible divergences between the objectives defined by each piece of legislation and the means to achieve it. Even if the usefulness of the employed tools to monitor TBT pollution has been proved, the WFD’s monitoring proposal will only be effective if: i) there is a good choice of the bioindicators species; and ii) imposex/intersex are specific responses to TBT pollution, i.e., if other contaminants induce imposex or intersex, then these biomarkers lose much of their operational value. For that reason this thesis presents novel information regarding these aspects in order to validate this methodology and better interpret the obtained results. Ria de Aveiro is an area that has been intensively studied regarding TBT pollution and, as previously reported, presented a major improvement of the ecological status regarding this priority pollutant. An opposite trend has been however observed in the imposex evolution in the gastropod Peringia ulvae. This species - regarded by some authors as a good bioindicator of TBT pollution - did not show an imposex recovery despite the fact that TBT levels have been consistently decreasing in this area. Instead, there was a global increase in the percentage of females affected by imposex and VDSI levels until 2012, and the imposex levels in 2015 were similar to those found in 1998. Possible reasons for this counter current pattern could be related with other factors that can influence imposex expression, such as parasitism, that probably cannot be totally controlled when monitoring is performed with this species. Hence, there is the need to carefully choose the right bioindicators to implement TBT monitoring assessments under WFD or MSFD, and P. ulvae is not recommended for this purpose. Imposex is not an exclusive response to TBT since triphenyltin (TPT), a related organotin, is already known to cause the same phenomenon in some gastropod species. This thesis describes, for the first time, that TPT also induces the development of imposex in N. lapillus, the species considered the key bioindicator in the WFD monitoring proposal. However, imposex development in TPT-injected females followed mostly an aphallic route (no penis development). These results suggest that TPT and TBT may act differently in the sequential process of female masculinization casting new insights about the hypothetical pathways underlying imposex development. Besides TBT and TPT, it is important to know if other environmental contaminants can induce or interfere with the imposex/intersex development to ensure that the proposed tools are specific to organotin pollution. With this purpose, a reporter gene assay was performed using the GAL4/UAS system in cells transfected with human receptors, which were already identified in gastropods: Retinoid X Receptor (RXR), Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ), Retinoic Acid receptor (RAR) and Estrogenic Receptor (ER). It has been reported in the literature that imposex is caused by the activation of the nuclear receptors RXR and/or PPARγ by TBT or TPT, and therefore if other contaminants can bind these receptors they could have the potential to induce imposex/intersex as well. Even if there were other substances that slightly activated RXR and PPARγ, none was able to do it with similar potency than the organotins (TBT and TPT), suggesting so far that these are the only tested substances capable to induce imposex at realistic environmental concentrations. Nevertheless, all substances that were able to activate the reporter gene were identified and their potential to cause endocrine disruption in gastropods is discussed. Concluding, the tools proposed in this thesis can be of extreme utility to monitor the aquatic environment under the frame of the recent EU directives. Mor