Immunopathogenesis of postnatal persistent infection generated by classical swine fever virus and its implication in the superinfection exclusion phenomenon

La peste porcina clásica (PPC) es una enfermedad viral altamente contagiosa de cerdos domésticos y salvajes, incluida en la lista de enfermedades de declaración obligatoria a la Organización Mundial de Sanidad Animal. El agente causal, el virus PPC (VPPC), pertenece al género Pestivirus, familia Flaviviridae. A pesar de los grandes esfuerzos dirigidos a controlar y erradicar la PPC, continúa siendo una de las enfermedades más importantes para la sanidad animal y la industria porcina en todo el mundo. La circulación y la importancia intrínseca de cepas de VPPC de baja y moderada virulencia en las regiones endémicas ha sido objeto de discusión en los últimos años. Varios trabajos han demostrado el papel de cepas de baja virulencia en el nacimiento de lechones persistentemente infectados (PI) con el VPPC. No obstante, los mecanismos involucrados en este tipo de infecciones por VPPC no son bien conocidos, y los estudios existentes datan de hace 40 años. Por otro lado, la posible generación de persistencia viral después de la infección postnatal con VPPC era todavía una cuestión a resolver. Esta tesis demuestra la capacidad de cepas de VPPC de baja y moderada virulencia de inducir persistencia vírica de forma postnatal en cerdo doméstico y salvaje. Para ello, cerditos recién nacidos fueron inoculados de forma intranasal con el VPPC. Durante seis semanas, estos lechones permanecieron aparentemente sanos, a pesar de no generar respuesta inmunológica celular ni humoral específica para VPPC. Se demostró viremia permanente y alta carga de virus en todas las muestras de tejido, secreciones y excreciones de los animales persistentemente infectados (PI), hasta el fin del estudio. Además, se demostró la ineficacia de la vacunación de cerdos PI, de seis semanas de edad, los cuales no generaron respuesta de IFN de tipo I ni de tipo II, ni de anticuerpos durante 21 días tras la vacunación con una vacuna viva atenuada de VPPC (la C-strain). La falta de detección del ARN vacunal mediante RT-qPCR específica en sangre, excreciones y tejidos, incluyendo la tonsila, sugirió la ausencia de replicación del virus vacunal en los animales PI y un posible fenómeno de interferencia viral. Finalmente, jabalíes de seis semanas de vida con infección persistente de VPPC (primera infección) fueron inoculados con una cepa de alta virulencia de VPPC (segunda infección o superinfección). Los jabalíes PI no desarrollaron signos clínicos y mostraron alta carga del virus primario, causante de la persistencia, en todas las muestras analizadas. Por el contrario, el virus secundario no fue detectado ni por RT-qPCR ni por secuenciación, demostrando así el fenómeno de exclusión de la superinfección (ESI). La ausencia de una respuesta de IFN de tipo I y II y de anticuerpos respaldó los resultados previos de los estudios de esta tesis. Estos hallazgos demostraron por primera vez la capacidad del VPPC para inducir ESI in vivo, en cerdos con infección persistente. El fenómeno ESI probablemente explicaría la falta de respuesta de los animales con infección persistente después de la vacunación con la vacuna viva atenuada. Considerando la existencia de cepas de virulencia baja a moderada y su capacidad para producir formas de infección persistente, los resultados aquí presentados pueden tener potenciales repercusiones epidemiológicas, especialmente en el contexto endémico. Es importante destacar que los animales persistentemente infectados pasarían desapercibidos bajo control serológico, dada la ausencia de respuesta de anticuerpos específicos. Esta tesis doctoral ha contribuido a la comprensión de la patogénesis producida por el VPPC, que depende no sólo de la virulencia de la cepa sino también de la interacción virus-huésped, y abre nuevas líneas de investigación para comprender los mecanismos subyacentes que conducen a la generación de inmunotolerancia y persistencia del VPPC.Classical swine fever (CSF) is a highly contagious viral disease of domestic and wild pigs, included in the list of diseases notifiable to the World Organisation for Animal Health. The causative agent, CSF virus (CSFV), belongs to the Pestivirus genus, Flaviviridae family. Over the last century, great efforts have been directed towards the control and eradication of CSF, which today remains one of the most important diseases for animal health and in the pig industry worldwide. The circulation and intrinsic importance of low and moderate virulence strains in the endemic regions has been extensively described. Also, it has been shown the role of these type of viral strains in the generation of “the pregnant carrier sow syndrome” and persistent infection of piglets after trans-placental transmission. However, the mechanisms involved in this form of CSFV infections are not well known, and the existing studies date over 40 years ago. By contrast, the possible generation of viral persistence after postnatal infection of pigs is still a question to resolve. Against this background, this thesis has demonstrated the capacity of low and moderate virulence CSFV strains to produce postnatal persistent infection early after birth. To this end, newborn piglets were inoculated intranasally with CSFV. During six weeks, these piglets remained apparently healthy, although they were not able to generate detectable CSFV specific humoral nor cellular immune responses, maintaining high virus load in blood, organs and body secretions and excretions. In addition, it has been demonstrated the ineffectiveness of vaccination of six-week-old PI pigs, which were unable to elicit a detectable innate immune response, in terms of IFN type-I production, as well as acquired immune responses (i.e. IFN type-II and antibodies) following vaccination with a CSFV live attenuated vaccine (C-strain). The RNA of the vaccine could not be detected by a specific RT-qPCR in any of the samples analysed after vaccination, including the tonsil, suggesting a superinfection exclusion (SIE) phenomenon between the persistently infecting virus (primary infection) and the CSFV vaccine strain (secondary infection). Finally, six-week-old wild boars with CSFV persistent infection (first infection) were inoculated with a CSFV strain of high virulence (second infection or superinfection). PI wild boars did not develop clinical signs and showed a high load of the primary virus, causing persistence, in all samples analysed. In contrast, the secondary virus was not detected by either RT-qPCR or sequence analyses, thus demonstrating the phenomenon of superinfection exclusion (SIE). The lack of innate and acquired immune responses supported the previous studies from this thesis. In addition, in vitro assays with the PBMCs isolated ex vivo from persistently infected animals, a well-known target for the CSFV viral replication, further corroborated the CSFV SIE phenomenon. These findings demonstrated for the first time the ability of CSFV to induce SIE in vivo, in swine with persistent infection. The SIE phenomenon would likely explain the unresponsiveness of animals with persistent infection after vaccination with the live attenuated vaccine. Considering the existence of CSFV strains of low and moderate virulence and their ability to produce persistent infection forms, the results showed here may have potential epidemiological repercussions, especially in the endemic context. Importantly, persistently infected animals would remain unnoticed under serological control, given the absence of specific antibody response. This doctoral thesis has contributed to the understanding of the pathogenesis of CSFV infection, which depends not only on the virulence of the strain but also on the virus-host interaction, and opens new lines of research to understand the immunological bases and of viral pathogenesis for the generation of immunotolerance and persistence, hitherto unknown