Targeting microglia necroptosis to arrest neuroinflammation

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Necroptosis is a caspase-independent form of regulated cell death executed via activation of receptor interacting protein 1 (RIP1) and RIP3, being negatively regulated by caspase-8. Neurodegenerative diseases are hereditary or sporadic conditions characterized by progressive cell death in selected areas of the nervous system, along with oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neuroinflammation. Importantly, recent studies have demonstrated that necroptosis is involved in the pathogenesis of several disorders, including neurodegenerative diseases. Neuroinflammation, in turn, is a response to eliminate the original insult and damaged or dead cells. However, if tissue physiology is not restored, inflammation becomes a chronic condition, where microglia plays a major role. Studies have shown that defects in caspase-8 activation in microglia may promote inflammation through activation of necroptosis. In the present study, we used the murine BV2 microglia cell line as an in vitro model to screen a library of novel compounds, potential modulators of necroptosis, and evaluate if necroptosis modulation may contribute to attenuate microglia-mediated inflammation. Importantly, we identified one hit Oxa12 that inhibits this type of regulated cell death by preventing all necroptosis-associated events, including RIP1/RIP3 necrosome assembly, and MLKL phosphorylation. In addition, Oxa12 decreased TNF-α gene expression and secretion as well as JNK and p38 MAPK activation, while IκB phosphorylation was increased. In conclusion, we established a robust in vitro model of microglia necroptosis and identified a strong inhibitor of this regulated form of cell death that might be a promising candidate molecule for targeting RIP1/3-driven pathologies.A necroptose é um tipo de morte celular regulada e independente de caspases, que ocorre quando há ativação das proteínas receptor interacting protein 1 (RIP1) e RIP3, sendo inibida pela caspase-8. As doenças neurodegenerativas são condições hereditárias ou esporádicas caracterizadas pela ocorrência de morte celular progressiva em áreas específicas do sistema nervoso, assim como pela existência de stress oxidativo, disfunção mitocondrial e neuroinflamação. É importante referir que estudos recentes têm demonstrado que a morte celular por necroptose está envolvida na patogénese de várias doenças, incluindo as doenças neurodegenerativas. A neuroinflamação, por sua vez, visa eliminar tanto a causa inicial do dano celular, como as células mortas que resultam do insulto original. Contudo, se a fisiologia normal do tecido não for restaurada, a inflamação torna-se uma condição crónica. No sistema nervoso central (CNS), são as células da microglia que constituem a primeira linha de defesa, desempenhando um papel crucial na neuroinflamação, através da contínua produção de citoquinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigénio, entre outros. Estes mediadores inflamatórios podem, por sua vez, ter efeitos neurotóxicos. De facto, a comunicação entre a microglia e os neurónios pode amplificar os sinais inflamatórios e contribuir para a patogénese das doenças neurodegenerativas. De salientar que, tal como descrito recentemente, a inativação de caspase-8 na microglia pode promover inflamação através da ativação da necroptose. No presente estudo, foi utilizada a linha celular de microglia de murino, BV2, como um modelo in vitro para o estudo de duas bibliotecas de novos compostos, potencialmente moduladores da necroptose. Para além disso, avaliámos se a modulação da necroptose pode contribuir para atenuar a inflamação mediada pela microglia. Em primeiro lugar, otimizou-se o modelo celular. Os resultados obtidos demonstraram que a incubação de células BV2 com o inibidor de caspases, zVAD-fmk, resultava em níveis elevados de morte celular por necroptose, tal como avaliado através de ensaios de viabilidade e citotoxicidade. Os resultados foram confirmados por Western blot, onde observámos um enriquecimento das proteínas RIP1 e RIP3 no proteoma insolúvel das células. Esta estrutura amiloide, ou necrossoma, desempenha um papel preponderante na ativação da necroptose. Pelo contrário, a incubação das células com o inibidor seletivo da atividade cinase da proteína RIP1, necrostatina-1 (Nec-1), reverteu totalmente a necroptose para níveis controlo. Após a otimização do modelo celular, testámos duas bibliotecas de compostos de famílias diferentes, onde identificámos a molécula Oxa12 como sendo capaz de inibir a necroptose na linha celular BV2. De facto, este composto reduziu os níveis de morte celular induzida por zVAD-fmk, em cerca de 80% (p < 0.05). Mais ainda, o composto Oxa12 reprimiu todos os eventos associados à necroptose, incluindo a formação do necrossoma e, também, a fosforilação do resíduo de serina 358 da proteína MLKL pela proteína RIP3. É de salientar que a fosforilação da MLKL neste resíduo induz a sua oligomerização e consequente migração para a membrana plasmática, onde promove a rutura da mesma, sendo por isso um evento crítico na execução da necroptose. Podemos, assim, concluir que o composto Oxa12 é um inibidor forte da necroptose. De forma a melhor caracterizar a atividade do composto identificado, determinámos a concentração à qual tem metade da sua atividade máxima (EC50), assim como a sua toxicidade. Os resultados obtidos demonstraram que o composto Oxa12 inibe a necroptose com um EC50 de 1,422 µM, revelando o seu potencial, mesmo a concentrações reduzidas. Para além disso, verificámos que este composto não induz toxicidade em células BV2 controlo, ou seja, sem qualquer tratamento, mesmo a elevadas concentrações. A necroptose é considerada uma forma de morte celular do tipo inflamatório, devido à libertação dos constituintes intracelulares para o espaço extracelular onde se encontram células imunitárias, tais como macrófagos, que podem potenciar a inflamação. Desta forma, a nossa hipótese foi a de que o composto Oxa12, ao inibir a necroptose, contribui para uma diminuição da inflamação. Assim, para além dos níveis dos transcritos de vários mediadores inflamatórios, tais como TNF-α, IL-1β, COX2 e NLRP3, avaliados por Real-Time PCR (RT-PCR), determinámos também os níveis de secreção de TNF-α, através da utilização de um ensaio de ELISA. Uma vez que a microglia constitui a principal linha de defesa do CNS, é bem conhecida a sua capacidade de produzir e libertar várias moléculas inflamatórias. Os resultados obtidos demonstraram que a incubação das células BV2 com zVAD-fmk resulta num aumento da transcrição dos genes TNF-α e IL-1β, assim como dos níveis de TNF-α secretados. Pelo contrário, a coincubação com Nec-1 foi capaz de reverter totalmente aqueles parâmetros. De particular importância é o facto do composto em estudo, Oxa12, ter diminuído os níveis de expressão e libertação de TNF-α. De forma a determinar quais as vias de sinalização especificamente moduladas pelo Oxa12, avaliámos os níveis de fosforilação de resíduos específicos das proteínas JNK (Treonina 183 e Tirosina 185) e p38 (Treonina 180 e Tirosina 182), componentes chave de duas vias de sinalização da família das MAP cinases. Os resultados revelaram um aumento significativo da fosforilação da proteína JNK, indicativos de ativação desta via, após incubação das células com zVAD-fmk, bem como a concomitante diminuição após adição de Nec-1 ou Oxa12. Estes resultados estão de acordo com os de outros autores, que referem a ativação da proteína JNK como um fator preponderante na indução da necroptose, nomeadamente promovendo a produção autócrina de TNF-α. Relativamente à proteína p38, a sua função na necroptose é ainda pouco conhecida, para além de contraditória. Enquanto alguns autores defendem que esta via de sinalização não interfere no mecanismo de morte, outros demonstraram que a inibição da necroptose induzida por TNF-α resulta na sua ativação. Curiosamente, os resultados obtidos neste trabalho revelaram um aumento dos níveis de p38 fosforilada após incubação das células com zVAD-fmk e, por sua vez, uma diminuição com Nec-1 ou Oxa12. É possível que este aumento de ativação com zVAD-fmk esteja relacionado com a indução de respostas inflamatórias, uma vez que tanto a via da JNK como da p38 estão envolvidas na inflamação. Para além das vias de sinalização mediadas pela família das MAP cinases, avaliámos também os níveis de fosforilação da proteína Akt. Estudos recentes demonstraram que a inibição da proteína Akt é protetora num modelo de necroptose induzida por TNF-α em células L929. No entanto, outros estudos descrevem que o tratamento celular apenas com zVAD-fmk não é suficiente para induzir a fosforilação e, consequente, ativação da proteína Akt, sendo necessária a atividade conjunta de TNF-α e zVAD-fmk. Por outro lado, outros autores demonstraram que o zVAD-fmk é capaz de induzir a ativação da proteína Akt, sendo essa ativação dependente especificamente da fosforilação do resíduo Treonina 308. No nosso estudo, usámos um anticorpo especifico para a fosforilação do resíduo Serina 473, o que poderá justificar a ausência de diferenças significativas entre as condições estudadas. Por fim, fomos avaliar a ativação do fator de transcrição NF-κB, indiretamente, através dos níveis de fosforilação do seu inibidor IκB. Os nossos resultados demonstraram uma diminuição dos níveis de IκB fosforilado em células BV2 tratadas com zVAD-fmk e um aumento concomitante após adição de Nec-1 e Oxa12, sugerindo uma ativação daquele fator de transcrição. Estes resultados estão de acordo com os obtidos em estudos anteriores, confirmando que a via de sinalização mediada pelo NF-κB não possui um papel preponderante na ativação da necroptose ou na expressão de TNF-α. Para além disso, é ainda possível que o composto Oxa12 promova um desvio da sinalização da necroptose para vias de sobrevivência celular mediadas pelo NF-κB. No entanto, são necessários mais estudos que confirmem esta hipótese. Em conclusão, estabelecemos um modelo celular robusto de necroptose em microglia e identificámos um forte inibidor químico deste tipo de morte celular regulada. O composto Oxa12 é um candidato promissor para ser utilizado na terapêutica de patologias associadas à ativação das proteínas RIP1 e RIP3.The studies presented in this thesis were performed within the Cellular Function and Therapeutic Targeting research group, at the Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa, under the supervision of Joana D. Amaral, PhD. and Cecília M. P. Rodrigues, PhD