Characterization of the molecular pathogenesis of a malformation syndrome associated with a complex double chromosome translocation

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Congenital anomalies are devastating conditions responsible for high neonatal mortality, as well as high morbidity of the surviving individuals. Chromosomal rearrangements are a leading cause of severe congenital malformations and are associated with about 25% of perinatal deaths due to congenital anomalies. The aim of this study is the identification of candidate genes responsible for the phenotype characterized by intrauterine growth retardation, severe developmental delay, brain malformations and refractory epilepsy identified in an individual with an apparently balanced de novo double chromosomal translocation t(2;7)(q23;q32),t(5;6)(q23;q26)dn. Identification and mapping of the structural chromosomal aberrations were performed by whole-genome array analysis, array painting with genomic amplicons of the derivative chromosomes and by whole genome sequencing of large-insert jumping libraries (liWGS). Subsequently all junction fragments were amplified and the breakpoints were identified at nucleotide resolution by Sanger sequencing. Genome array analysis identified a 651.76 kb deletion at 14q24.3 (g.76,673,181-77,324,937 [GRCh37/hg19]). Transforming growth factor beta 3 (TGFB3), a gene associated with autosomal dominant arrythmogenic right ventricular dysplasia and Loeys-Dietz syndrome (OMIM #107970 and #615582), is situated 224 kb upstream from the proximal deletion breakpoint.. Translocation breakpoints were identified both by array painting and liWGS. The 2q23.3 breakpoint of the t(2;7)(q23.3;q32.1), disrupts IVS5 of pre-mRNA processing factor 40 homolog A (PRPF40A), a protein coding gene related to Huntington’s disease (OMIM#143100). The calcium channel, voltage-dependent, beta-4 subunit (CACNB4) gene, localized 600 kb upstream of this breakpoint, is associated with three epilepsy related autosomal dominant disorders (OMIM #613855, 607682 and 607682). The Staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1 (SND1) gene disrupted by the 7q32.1 breakpoint, is not presently associated with any known phenotype. However, the RNA binding motif protein 28 coding gene (RBM28), situated 300 kb downstream of the 7q32.1 breakpoint, has been associated with progressive neurological defects (OMIM #612079). Concerning the t(5;6)(q23.2;q26) translocation, the 5q23.2 breakpoint is situated in an intergenic region whereas the 6q26 breakpoint disrupts IVS3 of PARK2 co-regulated gene (PACRG). This gene shares a bidirectional promoter with parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase (PARK2), which is associated with early onset Parkinson disease. About 300kb downstream of this breakpoint is the homolog of quaking mouse (QKI) gene that also plays a role in brain development. The application of liWGS unveiled the presence of two additional cryptic alterations on der(6), an excision/insertion and an inversion. The cryptic excision at 6q22.33 disrupts protein tyrosine phosphatase receptor type K (PTPRK), a gene from the protein tyrosine phosphatase family which is associated with tumor suppression. As a result of the excision/insertion, the excised 48 kb fragment containing PTPRK exon 7 and flanking intronic sequences is inserted 36 Mb further distal at 6q26. Located 70kb from the PTPRK gene, the laminin 2 (LAMA2) gene was reported has being involved in brain malformations, including polymicrogyria. The inversion breakpoint at 5q23.2 is located within an intergenic region. In conclusion, these findings suggest that disruption of PRPF40A and PACRG genes, in association with misregulation of CACNB4, RBM28, PARK2, QKI and LAMA2 genes from the breakpoint regions are the most likely candidate genes responsible for this complex malformation phenotype. Additionally the modulating effect of TGFB3 gene cannot be excluded. Comparative analysis of this complex chromosome rearrangement by array painting and liWGS demonstrates that currently only liWGS is able to identify the full spectrum of balanced, otherwise cryptic, structural alterations. In this way, liWGS allows high-throughput delineation of chromosomal rearrangements, allowing a better phenotype-genotype association. A major drawback of studying chromosome anomalies is the unavailability of relevant human biological material or of data from such samples. Theoretically, to overcome this issue, animal or induced pluripotent stem cells models can be used. During this study, the obtainment of a proband-specific iPSC model was attempted. Unfortunately, the complexity of the pluripotency induction process, the associated costs and the requisites of using non-viral vectors hinder the development of such cellular models for the study of the molecular pathogenesis of congenital anomalies. Proband derived lymphoblastoid cell line (LCL), non-integrative episomal plasmids containing the four Yamanaka factors – OCT3/4, c-MYC, SOX2 and KLF4 and an electroporation platform were used for the pluripotency induction experiments. Electroporated cells were maintained on a human foreskin fibroblasts (HFF) feeder-layer. While performing the reprogramming experiments, several technical difficulties were identified. A major difficulty is achieving high transfection efficiency of LCL with episomal plasmids without high cell mortality rates. Although no LCL derived iPSC colonies were obtained, the identification of the critical steps in the induction protocol of LCL derived cells will certainly contribute for further development of such cellular models. Furthermore, the availability of individual-derived iPSCs will definitely lead to a robust cellular model for the study of the molecular pathogenesis of chromosome rearrangements associated with congenital anomalies.As anomalias congénitas constituem uma das principais causas da mortalidade fetal, neonatal e infantil na Europa. Adicionalmente, devido à gravidade dos fenótipos apresentados pelos indivíduos que sobrevivem, este tipo de anomalias contribui em grande medida para a morbilidade, sobrecarregando em muito o sistema público de saúde. Os rearranjos cromossómicos constituem uma das principais causas no desenvolvimento de malformações congénitas graves e estão associados a cerca de 25% das mortes devidas a anomalias congénitas no período perinatal. Por seu lado, os rearranjos cromossómicos estruturais, nomeadamente deleções, duplicações, inversões e translocações cromossómicas, têm vindo a ser recorrentemente associados a diversos fenótipos deletérios, nomeadamente síndromes malformativos caracterizados por atraso global do desenvolvimento psicomotor e anomalias cerebrais graves. O principal objetivo deste estudo é a identificação de genes candidatos responsáveis pelo fenótipo caracterizado por atraso do crescimento intrauterino, atraso grave do desenvolvimento psicomotor, malformações cerebrais e epilepsia refratária identificado num indivíduo portador de uma translocação cromossómica dupla de novo, aparentemente equilibrada - t(2;7)(q23;q32),t(5;6)(q23;q26)dn. A identificação e mapeamento das alterações cromossómicas estruturais foi realizada através da utilização de array genómico, de array painting com amplicões dos cromossomas derivados e ainda por sequenciação pangenómica de grandes insertos (do inglês large-insert Whole Genome Sequencing). Seguidamente, todos os fragmentos de junção das diversas alterações estruturais foram amplificados e os respetivos pontos de quebra foram identificados com resolução nucleotídica por sequenciação de Sanger. Através da análise do array genómico foi possível a identificação de uma deleção de 651.76 kb na banda 24.3 do cromossoma 14, nas posições g.76,673,181- 77,324,937 (Genoma de Referência [GRCh37/hg19]). A montante do ponto de quebra proximal da deleção, a uma distância de 224 kb, o gene codificante para o fator de transformação do crescimento beta 3 (TGFB3) encontra-se associado a duas doenças autossómicas dominantes, displasia arritmogénica do ventrículo direito e síndrome de Loeys-Dietz (OMIM#107970 e #615582). Os pontos de quebra da translocação dupla foram identificados por array painting e por sequenciação pangenómica de grandes insertos. O ponto de quebra do derivado do cromossoma 2 da t(2;7)(q23.3;q32.1) interrompe o homólogo para o fator 40 de processamento de pré-mRNA (PRPF40A), um gene codificante para uma proteína associada com a doença de Huntington (OMIM#143100). O gene codificante para a subunidade beta do canal de cálcio dependente de voltagem (CACNB4), localizado 600 kb a montante deste ponto de quebra está associado com três condições autossómicas dominantes que envolvem diversos variantes de epilepsia (OMIM #613855, #607682 e #607682). O gene codificante para a nuclease estafilocócica e domínio tudor 1 (SND1), que se encontra interrompido pelo ponto de quebra do derivado do cromossoma 7, não está, presentemente, associado a qualquer fenótipo conhecido. Por outro lado, o gene codificante para a proteína 28 de ligação de RNA (RBM28), localizado 300 kb a jusante do ponto de quebra deste derivado, tem vindo a ser associado a defeitos neurológicos progressivos (OMIM #612079). Relativamente à translocação t(5;6)(q23.2;q26), o ponto de quebra do derivado do cromossoma 5 está localizado numa região intergénica, enquanto que o ponto de quebra da translocação no derivado do cromossoma 6 interrompe o terceiro intrão do gene co-regulador da Parkina (PACRG). Este gene partilha um promotor bidirecional com o gene codificante para a proteína ubiquitina ligase da Parkina RBR E3 (PARK2), o qual se encontra associado com o aparecimento precoce da doença de Parkinson. A jusante deste ponto de quebra, a cerca de 300 kb, encontra-se o gene homólogo do murganho quaking (QKI), o qual apresenta igualmente um papel no desenvolvimento cerebral. A aplicação da sequenciação pangenómica de grandes insertos revelou a presença de duas novas alterações crípticas no derivado do cromossoma 6, uma excisão/inserção e uma inversão. A excisão críptica na banda q22.33 no derivado do cromossoma 6 interrompe o gene codificante para o recetor da proteína tirosina fosfatase tipo K (PTPRK). Este gene é um membro da família das proteínas fosfatases de tirosina que se encontram maioritariamente associadas à supressão de tumores. Como resultado da excisão/inserção o fragmento excisado, que tem uma extensão de 48 kb, contém o exão 7 do gene PTPRK e flanqueia sequências intrónicas, é inserido a montante no ponto de quebra da banda 6q26, a uma distância de 36 Mb. Localizado 70 kb a jusante do gene PTPRK, o gene codificante para a laminina 2 (LAMA2) foi reportado como estando envolvido em malformações cerebrais, incluindo polimicrogiria. Por outro lado, o ponto de quebra da inversão no 5q23.2 está localizado numa região intergénica. Em suma, os dados encontrados sugerem que a interrupção dos genes PRPF40A e PACRG, em associação com a desregulação dos genes CACNB4, RBM28, PARK2, QKI e LAMA2 que flanqueiam as regiões dos pontos de quebra, serão os genes candidatos mais prováveis para a explicação do fenótipo reportado de malformação complexa. Adicionalmente, o efeito modulador do gene TGFB3, que se encontra a montante do ponto de quebra proximal da deleção no cromossoma 14, não poderá para já ser excluído. A análise comparativa deste rearranjo cromossómico complexo por array painting e por sequenciação pangenómica de grandes insertos, permitiu demonstrar que, neste momento, apenas a última abordagem tem a capacidade de identificar o espectro completo dos rearranjos cromossómicos estruturais aparentemente equilibrados, que de outra forma continuariam desconhecidos. Desta forma, a sequenciação pangenómica de grandes insertos permite a delineação dos rearranjos cromossómicos estruturais com uma elevada resolução, permitindo uma associação mais fiável entre o genótipo e o fenótipo reportados. Um dos principais obstáculos no estudo de anomalias cromossómicas é a indisponibilidade de material biológico humano relevante, bem como de dados acerca desse mesmo material biológico. Teoricamente, de forma a ultrapassar este problema poderão se utilizados modelos animais ou modelos celulares, incluindo células pluripotentes induzidas. Durante o decorrer deste estudo foram iniciadas as experiências para a obtenção de um modelo de células pluripotentes induzidas específicas do indivíduo portador da translocação t(2;7)(q23;q32),t(5;6)(q23;q26)dn. Contudo, a complexidade do processo de indução de pluripotência, os custos associados e a necessidade da não utilização de vetores virais, dificultou grandemente o desenvolvimento deste modelo celular para o estudo da patogénese molecular das anomalias congénitas apresentadas. De forma a realizar as experiências de indução de pluripotência foram utilizadas linhas linfoblastóides derivadas do indivíduo índex, plasmídeos epissomais não integrativos contendo os quatro fatores de Yamanaka - OCT3/4, c-MYC, SOX2 e KLF4 – e uma plataforma de eletroporação celular. As células eletroporadas e em processo de indução foram mantidas numa camada de suporte constituída por fibroblastos de prepúcio humano inativados por radiação gama. Ao longo do desenvolvimento destas experiências foram encontradas diversas dificuldades técnicas. A principal dificuldade encontrada deteve-se na obtenção de uma elevada eficiência de transfecção da linha linfoblastóide com os plasmídeos epissomais sem obter, simultaneamente, taxas de mortalidade excessivamente elevadas. Apesar de não ter sido possível a obtenção de colónias de células pluripotentes derivadas da linha linfoblastóide, foram identificados os passos críticos do protocolo de indução, o que contribuirá certamente para o futuro desenvolvimento destes modelos celulares. Adicionalmente, a disponibilidade de células pluripotentes induzidas específicas para cada indivíduo portador de um rearranjo cromossómico irá definitivamente conduzir a um modelo celular robusto para o estudo da patogénese molecular dos rearranjos cromossómicos associados com anomalias congénitas e síndromes malformativos. Da mesma forma, a possibilidade de diferenciar células pluripotentes induzidas específicas de um indivíduo índex em quaisquer células dos três folhetos embrionários é, sem dúvida, uma vantagem no estudo dos rearranjos cromossómicos