Neuronal mechanisms underlying sex hormone dependent behavior modulation

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Durante a sua vida, um animal necessita de interagir com o ambiente que o rodeia de forma a aumentar a sua probabilidade de sobrevivência e sucesso reprodutor. Situações favoráveis ou nocivas surgem constantemente e devem ser interpretadas da forma mais eficiente possível. No caso específico de interações sociais estas devem fundamentar-se na interação entre o estado fisiológico interno de um animal e os estímulos externos que recebe, de forma a que o comportamento adaptativo mais benéfico possa ser selecionado. Sabe-se que, conforme uma determinada condição interna, um animal pode responder de forma bastante distinta ao mesmo estímulo, porem, os mecanismos neuronais que medeiam esta seleção são pouco compreendidos. Um dos mais importantes estados fisiológicos capaz de modular respostas comportamentais é a fase do ciclo reprodutivo em que uma fêmea se encontra. Por exemplo, numa fase recetiva uma fêmea pode aceitar um macho que tem como objetivo acasalar, mas cerca de dois dias mais tarde a mesma fêmea, interagindo com o mesmo macho, irá mais provavelmente rejeitá-lo, exibindo normalmente comportamentos agressivos. Pensa-se que hormonas esteróides como a progesterona ou o estrogénio possam actuar como variáveis internas capazes de mediar estes comportamentos adaptativos. Estas interagirem com receptores específicos expressos em diversas regiões do cérebro envolvidas em comportamento social. Desta forma podem regular a atividade neuronal das células com às quais se ligam. Uma destas regiões de interesse é a porção ventro-lateral do hipotálamo ventro-medial (VMHvl). Este núcleo é importante para um vasto conjunto de interações sociais, tais como agressão ou aceitação de um macho conspecífico como possível parceiro de acasalamento. Apresenta uma população heterogénea de células, sendo uma delas a que expressa receptores para progesterona. Recebe ligações aferentes indiretas e polisinápticas de regiões envolvidas em representar estimulação sensorial relacionada com conspecíficos. Isto induz a ativação de immediate early genes (IEGs), marcadores indiretos de atividade neuronal. Outros motivos para nos interessarmos no VMHvl incluem, experiencias de inativação de receptores de progesterona (PgR) que provoca a perda de recetividade sexual em fêmeas e a descoberta recente de que um estado recetivo numa fêmea aumenta a resposta neuronal no VMHvl quando expostas a um macho conspecífico. No entanto, muito pouco se sabe acerca da natureza molecular e características funcionais da população neuronal que está, de facto, a ser ativada durante estes testes de exposição a machos. Para tentar abordar estas e outras questões este projeto apresenta várias metodologias que pretendem esclarecer certos aspetos da integração neuronal que ocorre durante estas interações sociais e de que forma estes mecanismos podem ser explicados. Para isso efetuou-se um estudo de marcação-dupla para RNA mensageiro de receptores de progesterona (PgR mRNA) e para a expressão proteica de c-Fos, um IEG bastante comum em estudos de representação de atividade neuronal. Este método pode permitir compreender qual é a percentagem de população de neurónios que está a ser ativada em resposta a diferentes estímulos sociais. Também permite saber se essas mesmas células expressam PgR ou se existem neurónios sem PgR (PgR-) capazes de responder especificamente a um ou outro género. Outra questão que queríamos esclarecer implica compreender quais os inputs para células PgR+ do VMHvl e comparar esses inputs com os que se ligam diretamente a todo o VMH, isto ajudaria a compreender até que ponto as células PgR+ são uma subpopulação do restante VMH e de que forma estão integradas na rede neuronal mais direta. A experiência de marcação-dupla foi efetuada num background de testes de comportamento de forma a ser possível comparar a expressão de proteína c-Fos em resposta a um estímulo feminino ou masculino. No entanto não se verificaram diferenças aparentes de c-Fos no VMHvl de fêmeas que foram sujeitas a estes testes comportamentais. Tal não era esperado porque se sabe que esta região apresenta elevada atividade neuronal mesmo durante as primeiras fases de interação social. No entanto, o núcleo premamilar (PMV) apresenta forte expressão de c-Fos quando a fêmea é exposta a um macho. Isto pode indicar que outros IEGs deveriam ser usados para observar indiretamente de forma mais fidedigna actividade neuronal no VMHvl. No que toca aos marcadores de PgR mRNA, apesar de serem usados regularmente em vários estudos histológicos, ainda não foi possível otimizar o protocolo que permitiria observar simultaneamente atividade neuronal e receptores para progesterona no mesmo cérebro. O estudo de inputs directos utilizou um método baseado em rabies-viral-tracing para localizar apenas ligações aferentes diretas para os neurónios PgR+ do VMHvl. Obtivemos três cérebros com uma população de células alvo bastante concentrada no VMHvl e padrões idênticos de inputs ao longo do cérebro. Tivemos, portanto, uma base bastante sólida para interpretar e descrever a regiões envolvidas. A maior parte dos inputs vieram de regiões previamente implicadas em comportamento social e algumas já tendo sido descritas como outputs das células PgR+ do VMHvl, havendo, portanto, algum nível de crosstalk. Algumas das localizações de inputs observadas foram inesperadas e é ainda necessário proceder a uma análise mais rigorosa e quantitativa dos dados.Social interactions rely on an interplay between external stimuli and internal states to induce specific adaptive behaviors. Depending on its internal condition, an animal might respond differently to the same stimulus. The reproductive cycle is one of the major internal factors capable of changing these behaviors. Sex hormones, e.g. progesterone, might be responsible for modulating behavior by binding to cognate receptors widely expressed across the brain, particular in regions involved in sexual behavior. One such region, the ventrolateral portion of the ventromedial hypothalamus (VMHvl), which plays a major role in sociosexual and aggression behavior in female and male mice, respectively. It is known that, in a sexually receptive state, females have increased neuronal activity in the VMHvl when in the presence of males, however, little is known about the identity of the neurons whose activity is being modulated. To clarify this question, we decided to focus our efforts in one population of VMHvl neurons: neurons that express the progesterone receptor (PgR+ neurons), which we know are male only responsive. In this thesis, we identified the monosynaptic inputs to the PgR+ neurons of the VMHvl using transsynaptic retrograde viral tracing and propose a double-labeling technique based on in situ and immunofluorescence to characterize neurons in the VMHvl that are male responsive. This way, we hope to better understand the neuronal populations of this nucleus in terms of gender specific responses. Our labeling approach was not successful but appears to indicate that c-Fos might not be a good neuronal activity reporter in our behavior paradigm. We found reliable input patterns to PgR+ neurons in the VMHvl originating from several regions of the social brain network, some of them already known to be outputs of these same cells, and new regions still to be described