Comportamento cromatográfico de polissacáridos de origem fúngica em quelatos de metal imobilizado

Trabalho final de mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e BiológicaOs polissacáridos têm atraído enorme atenção, devido às propriedades biológicas que exibem, e destes compostos destacam-se os β -glucanos com importantes actividades anti-tumorais e imunomodeladoras. Existem diversos estudos que investigam as actividades biológicas dos β -glucanos, no entanto as suas características estruturais ainda não são totalmente conhecidas. O presente trabalho teve como objecto de estudo os β -glucanos produzidos por basidiomicetos, em particular os que possuem estruturas terciárias em tripla hélice, pois são a estes compostos que têm sido atribuídos, por exemplo, efeitos de inibição de células tumorais. Neste contexto, foram cultivadas diversas espécies de basidiomicetos em meios contendo diferentes resíduos agro-industrias, tendo em vista a superprodução de β -glucanos. A utilização destes resíduos para o cultivo de basidiomicetos, conduziu à sua valorização e uma redução de custos associada ao desenvolvimento dos meios de cultivo. Os resíduos que permitiram um crescimento mais rápido dos basidiomicetos estudados foram a tremocilha, borra de café, casca de banana e casca de aveia. Do estudo sistemático realizado, verificou-se que são factores significantes para a produção de β -glucanos extracelulares: a espécie de basidiomiceto, a concentração de resíduo agro-industrial e o tempo de cultivo. A concentração de -glucanos mais elevada (141,16 mg/L), determinada pelo método do corante Congo red, foi obtida por fermentação submersa de Lentinula edodes em meio contendo 400 g/L de borra de café. Neste trabalho, foi também avaliada a emissão fluorescente e fosforescente das amostras de β -glucanos. No que respeita à fluorescência dos β -glucanos de L. edodes, verificou-se um aumento da intensidade de emissão com a concentração de β-glucanos. A sensibilidade desta técnica luminescente mostrou ser mais elevada com λ exc = 420 nm e λem = 528 nm. Tendo em vista o fraccionamento numa única etapa dos -glucanos extracelulares de L. edodes, avaliou-se, num estudo pioneiro, o comportamento cromatográfico em quelatos de metais de transição imobilizados. A adsorção às matrizes de IMAC foi influenciada pelo comprimento do braço espaçador, tipo de ligando e metal, tendo a adsorção dos β -glucanos aos metais imobilizados seguido a seguinte ordem: Cu2+>Zn2+>Ni2+>Co2+, utilizando o IDA como ligando. O perfil cromatográfico desses compostos numa coluna de IMAC, empacotada com Sepharose 4B-EDB-IDA- Cu2+, a pH 8, demonstrou que é possível separar dois tipos distintos de β -glucanos, os que não são adsorvidos e os que ficam retidos na matriz, sendo estes últimos apenas eluídos com imidazole. Esta evidência sugeriu que os compostos retidos possuem grupos doadores de electrões, capazes de interactuarem com o ião cobre. As amostras de β -glucanos fraccionadas revelaram também elevados valores de A280nm, o que indiciou a presença de proteínas livres ou de complexos proteína-polissacáridos. Algumas fracções cromatográficas foram também analisadas por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier, que permitiu identificar em todas as fracções estudadas bandas características dos β -glucanos, mas não uma das bandas típicas dos complexos proteína-polissacáridosAbstract: The polysaccharides have drawn a huge attention, due to their biological properties, and from these compounds, the β-glucans stand out with their important antitumoral and immunomodulators activities. There are various studies, which investigate the β-glucans biological activities, however their structural characteristics aren’t totally known yet. The present work focuses on studying the β-glucans produced by basidiomycetes, with particular regard to those having triple helix tertiary structures, because it is to these compounds that for instance tumor cell inhibition effects have been attributed. Therefore seeking the overproduction of β-glucans several basidiomycete species were grown in media containing different agro-industrial wastes. The use of low-cost agroindustrial wastes for β-glucans production led to wastes valorization and reduces significantly production costs. The wastes that allowed a faster growth of the studied basidiomycetes were yellow lupine, waste coffee, banana peel and oat husks. From the systematic study carried out, it was verified that the significant factors for the production of extracellular β-glucans are: the basidiomycete species, agro-industrial waste and incubation time. The highest concentration of β-glucans (141,16 mg/L), determined by the Congo Red dye method, was obtained by submerged fermentation of Lentinula edodes in medium containing 400 g/L of coffee grounds. In this work, the β-glucans samples fluorescence and phosphorescence emission was also evaluated. Regarding L. edodes β-glucans fluorescence, there was an increase in the emission intensity with β-glucans concentration. The sensitivity of this luminescente assay was shown to be higher with λexc= 420 nm and λem= 528 nm. Pursuing the one-step fractionation of extracelular β-glucans from L. edodes the chromatographic behavior of those compounds on immobilized transition metal chelates was evaluated. Adsorption to IMAC matrices was affected by the length of the spacer arm, type of ligand and metal. In the case of IDA as ligand, the absorption of immobilized metals for β-glucans followed the order: Cu2+>Zn2+>Ni2+>Co2+ The chromatographic profile of these compounds on an IMAC column packed with Sepharose 4B-EDB-IDA-Cu2+at pH 8, demonstrated that it is possible to separate two distinct types of β-glucans, those who aren’t adsorbed and those that are retained in the chromatographic matrix, the latter being only eluted with imidazole. This evidence suggested that the retained compounds have electron donor groups, capable of interacting with the copper ion. The fractionated β-glucan samples also showed high A280 nm values, which indicates the presence of free proteins or protein-polysaccharides complexes. Some chromatographic fractions were also analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Several absorption bands in FTIR spectra were assigned to β-glucans, however bands due to protein-polysaccharides complexes were not observed.N/