La chinasi HIPK2 regola la citochinesi attraverso la proteina spastin che ha la capacità di tagliare i microtubuli

The oncosuppressor HIPK2 is a kinase involved in the cell fate decisions in the development and response to stress. Recently, it is demonstrated the relevance of this kinase in the control of cytokinesis and prevention of chromosomal instability (CIN). HIPK2 is required for cytokinesis and prevents tetraploidization by phosphorylating the extra-chromosomal histone H2B at the midbody, the organelle-like structure formed at the cleavage furrow between the two daughter cells (Rinaldo et al., 2012). HIPK2-depleted cells do not successfully complete cytokinesis, leading to polyploidization, CIN, and increased tumorigenicity (Valente et al., 2015). To get hints on the mechanism through which HIPK2 controls cytokinesis, we have investigated the interplay between HIPK2 and crucial cytokinesis factors by analyzing their epistatic localization relationships at midbody in HIPK2-depleted cells (H-i). Our results show that HIPK2 depletion does not affect the localization of proteins involved in midbody formation/stabilization (i.e. CPC proteins, PLK1, MKLP1, MgcRacGAP1, PRC1, ECT2 and citron Kinase), while strongly affects the localization of the microtubule severing protein spastin, whose activity is required for abscission, final step of cytokinesis. Spastin could not be detected at the midbody in a high percentage (37±4.9%) of H-i cells. Spastin possesses microtubule (MT)-severing ability and contributes to different processes involving MT/cytoskeleton, such as cytokinesis, membrane modelling, intracellular and axonal vesicle transports (Trotta et al., 2004; Connell et al., 2009). Interestingly, we noticed that H-i cells show cytokinesis defects strongly resembling those of spastin-depleted cells and spastin overexpression rescues H-i cytokinesis defects, but not H2B phosphorylation at the midbody, indicating that the two events are independent. A biochemical characterization of the HIPK2/spastin cross-talk showed that HIPK2 directly regulates spastin levels in a phosphorylation-dependent manner. In particular, HIPK2 phosphorylates spastin at S268 and this phosphorylation is required for spastin stability. Notably, we have observed that overexpression of a stable, phosphomimetic spastin S268D mutant, but not an unstable, non-phosphorylatable S268A mutant, rescues cytokinesis defects in H-i cells. Overall, these findings support the idea that HIPK2-mediated phosphorylation of spastin contributes to reach the spastin dosage required for abscission.L'oncosoppressore HIPK2 è una chinasi che regola la proliferazione ed il destino cellulare sia durante lo sviluppo che nella risposta allo stress genotossico. Recentemente è stato dimostrato un suo ruolo nel controllo della citochinesi e nella prevenzione dell'instabilità cromosomica attraverso la fosforilazione dell’istone extracromosomale H2B in serina14 (P-H2B-S14) al midbody, un sottile ponte citoplasmatico che si forma tra le due cellule figlie in divisione (Rinaldo et al., 2012). Infatti, cellule prive di HIPK2 falliscono la citochinesi e portano alla formazione di cellule bi- e multinucleate, la cui proliferazione in un contesto tumorale si associa ad una maggiore instabilità cromosomica e ad una maggiore tumorigenicità sia in vitro che in vivo (Valente et al. 2015). Per comprendere il meccanismo con il quale HIPK2 regola la citochinesi, noi abbiamo effettuato un’analisi dei rapporti epistatici di localizzazione al midbody di fattori noti della citochinesi in cellule prive di HIPK2 (H-i) e studiato le relazioni che intercorrono tra HIPK2 e questi fattori. I nostri studi mostrano che le principali proteine coinvolte nella formazione e stabilizzazione del midbody (come PLK1, MKLP1, MgcRacGAP1, PRC1, ECT2, citron Kinase e Aurora B) non sembrano essere influenzate dall’assenza di HIPK2, mentre alcune proteine dell’abscissione appaiano disorganizzate al midbody, indicando quindi un ruolo di HIPK2 in quest’ultima fase della citochinesi. L’unico fattore ad essere assente al midbody (nel 37±4.9% dei casi) nelle cellule H-i è spastin, la severasi responsabile del taglio finale dei microtubuli del midbody che porta alla separazione delle due cellule figlie (Connell et al. 2009). Noi abbiamo osservato che cellule H-i mostrano difetti di citochinesi molto simili a quelli di cellule prive di spastin e che l'over-espressione di spastin nelle cellule H-i recupera i difetti di citochinesi, ma non P-H2B-S14 al midbody, indicando che i due eventi sono indipendenti. Caratterizzando biochimicamente la relazione esistente tra HIPK2 e spastin, abbiamo dimostrato che HIPK2 regola spastin a livello post trascrizionale in maniera fosforilazione-dipendente. Abbiamo osservato che HIPK2 fosforila spastin in serina 268 in vitro e la fosforilazione di questo sito sembra essenziale per mantenere alti i livelli proteici di spastin. In accordo con questi risultati, l'over-espressione di un mutante fosfomimetico di spastin, ma non di un mutante non fosforilabile, porta al recupero dei difetti di citochinesi nelle cellule H-i. Quindi, possiamo concludere che HIPK2 regola indirettamente la citochinesi, perchè’ attraverso la fosforilazione di spastin contribuisce a mantenere i livelli proteici di spastin richiesti per l’abscissione.Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellular