Immunohistochemical evaluation of cell mediated and innate immune response in pigs naturally infected with Mycoplasma hyopneumoniae

Il Mycoplasma hyopneumoniae (MH) è il principale agente causale della polmonite enzootica del suino. 49 suini con lesioni polmonari, provenienti da 5 diversi allevamenti sono stati campionati al macello. Per ogni animale è stata effettuata una valutazione delle lesioni polmonari secondo il metodo. Inoltre, da alcune carcasse, sono stati prelevati campioni di tessuto adiposo per rilevare i Toll like recptor 4. MH è stato ricercato dai campioni di polmone tramite RT-PCR. Le sezioni di polmone incluso in paraffina sono state valutate istologicamente, classificandole da 0 a 4, per reattività dei BALT, gravità della disepitelizzazione bronchiale e bronchiolare, e infiammazione subacuta. Tecniche di immunistochimica sono state eseguite usando anticorpi commerciali anti-MAC387 per rivelare i macrofagi, antiCD3 per i linfociti T, anti-CD79α per i linfociti B, Foxp3 per rilevare i Treg. La presenza di cellule immunopositive è stata classificata da 0 a 4 a seconda della quantità di cellule colorate per i linfociti T e B e per i macrofagi. I Treg sono stati contati individualmente nei BALT. I Toll like receptor sono stati evidenziati nel tessuto adiposo congelato utilizzando un anticorpo commerciale anti-TLR4 su sezioni di 5µm. La media dello score istologico è variata da 0,14 a 1,98. Alla RT-PCR sono risultati positivi 32 campioni mentre 17 sono risultati negativi. Nei polmoni si evidenziava una polmonite catarrale bronco-interstiziale con aumento di volume del tessuto linfoide peribronchiale, peribronchiolare e perivascolare. 10 campioni mostravano un’infiammazione subacuta e, 22, lesioni indotte da MH senza apparenti infezioni secondarie. Le cellule MAC387 positive erano numerose nelle lesioni polmonari (classificate come 4) con una grave infiammazione subacuta, mentre le cellule B, T e Treg erano poco rappresentate. Al contrario, i linfociti T erano molto presenti nei BALT iperplastici (classificati 3 e 4) da MH. I linfociti B erano poco rappresentati nelle infiammazioni subacute, mentre nei BALT con aumento di volume indotto da MH sono stati classificati da 2 a 3. L'espressione dei TLR4 è stata valutata su 20 campioni, utilizzando una classificazione semi-quantitativa basata su diffusione e intensità della calorazione in quattro livelli: assente, moderata, media, intensa su 4 campi visivi. In questo studio, si rielva che i Treg sono molto rari nei BALT iperplastici, suggerendone una minor attività nel ruolo di mantenere una bassa attivazione del sistema immunitario. I macrofagi sono numerosi nell'infiammazione subacuta, mente sono meno nei BALT iperplastici da MH, suggerendo una minor apoptosi cellulare nei centri dei follicoli. L'analisi semi-quantitativa dell'espressione dei TLR4 nel tessuto adiposo del mediastino effettuata in questa ricerca, tende a confermare quanto riscontrato in medicina umana: i soggetti che presentano una maggior infiammazione presentano anche una più alta intensità di colorazione rispetto a quelli con minor infiammazione; ulteriori studi sono comunque necessari per confermare quest'ipotesi.Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is the main causative agent of enzootic pneumonia of pigs. 49 pigs, presenting lung lesions, from 5 different herds were sampled at slaughterhouses. Lung lesions were individually. Mediastinal adipose tissue was sampled from some carcasses to reveal Toll like receptors 4. MH was locally RT-PCR detected from each lung lesion. Paraffin sections of lungs were histologically evaluated with a score, ranging from 0 to 4, for BALT, severity of bronchi, bronchiolar disepithelization and subacute inflammation. Immunohistochemistry was carried out using commercial antibodies anti-MAC387 to detect macrophages, anti-CD3 for T-cells, anti-CD79α for B-cells, Foxp3 for regulatory T-cells. The amount of antigen detected was scored from 0 to 4 based on the number of positive T, B and macrophages. T-reg cells were individually counted in BALT. To detect Toll-like receptors in mediastinal adipose tissue immunohistochemistry was carried out using a commercial antibody anti-TLR4 on frozen 5 µm section. The average histological lung score ranged from 0.14 to 1.98. Results of RT-PCR were 32 positive and 17 negative samples. Lungs showed catarrhal bronco-interstitial pneumonia with increased volume of peribronchial, peribronchiolar and perivascular lymphoid tissue. 10 samples showed subacute inflammation and 22 showed lesions MH induced without secondary apparent bacteria irruption. MAC387 positive cells were numerous in lung lesions (scored 4) affected by severe subacute inflammation while B, T and Treg cells were poorly represented. On the contrary, T cells were numerous in hyperplatic BALT MH induced (scored 3 to 4). B cells were scarcely represented in subacute inflammatio, while in MH induced BALT lesions were scored from 2 to 3. The expression of TLR4 was evaluated on 20 samples, using a semi-quantitative classification according to the spread and intensity of staining on four levels: absent, mild, medium, intensive on four, 4 magnifications fields. This study shows that Treg cells are very rare in hyperplastic BALT, suggesting a less active role of Treg cells in maintaining a low activation of immune system. Macrophages are numerous in subacute inflammation, while less in MH BALT, suggesting a low grade of apoptosis of cells of the follicle center. Semi-quantitative analysis of the presence of TLR4 in mediastinal fat tissue, carried out in this research, tends to confirm data shown in human medicine: those subjects who showed an more severe inflammation showed a high stain intensity than those with mild inflammation; further studies are needed to confirm this hypothesis