POSSIBLE MECHANISMS AND VIRULENCE FACTORS OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS IN VITRO AND EX VIVO

Citomegalovirus umano (HCMV) è un virus erpetico ubiquitario e molto diffuso nella popolazione, come dimostra l’elevata sieroprevalenza a livello mondiale. Come tutti i membri della famiglia di appartenenza, dopo l’infezione primaria HCMV può stabilire uno stato di latenza nell’ospite, con possibilità di dare luogo a riattivazione. Sia l’infezione primaria, sia la riattivazione possono essere clinicamente silenti oppure sintomatiche, con quadri clinici di notevole gravità e possibili conseguenze fatali in particolari categorie di soggetti. Tra tali conseguenze quelle più importanti sono nei neonati con infezione congenita da HCMV, trasmessa da madri con infezione primaria e nei soggetti trapiantati d’organo, per i quali l’evento più frequente è, in genere, la riattivazione del virus dalla latenza. Per potere meglio delineare i quadri clinici di cui HCMV si rende responsabile, è bene sottolineare che il possibile esito dell’infezione è il risultato di una serie di fattori, alcuni dei quali legati all’ospite ed altri a determinanti prettamente virali. Tra i possibili fattori responsabili della virulenza e del tropismo tessutale di HCMV sono state indicate specifiche glicoproteine (g) del pericapside virale, quali gB, gN e gO, coinvolte in processi cruciali del ciclo replicativo virale. I geni che codificano per le suddette proteine sono polimorfici, ossia presentano regioni ipervariabili che danno origine a diversi genotipi co-circolanti in natura. Sulla base di tali considerazioni supportate da evidenze scientifiche, è plausibile ritenere che genotipi diversi possano modulare in maniera differenziale il tropismo tessutale e d’organo di HCMV e, di conseguenza, influenzare i possibili esiti dell’infezione. In tale ottica, l’analisi dei polimorfismi genici di HCMV come marcatori di virulenza e la valutazione del loro valore prognostico nei riguardi della severità dell’infezione da HCMV appare di notevole rilevanza. È anche probabile ritenere che il profilo fenotipico di uno specifico ceppo virale di isolamento clinico sia più appropriatamente definito attraverso la caratterizzazione di combinazioni di diversi genotipi, piuttosto che da singoli genotipi. Per effettuare uno studio ex vivo, volto alla caratterizzazione dei genotipi virali gB, gN e gO attraverso analisi del polimorfismo di restrizione, sequenziamento genico ed analisi filogenetica, la categoria di soggetti presa in considerazione è rappresentata da bambini con infezione congenita da HCMV. In particolare, è stata considerata una coorte di quaranta soggetti pediatrici con infezione congenita (19) o con infezione post-natale (21) da HCMV, al fine di verificare la presenza di specifici genotipi e di combinazioni genotipiche come marcatori di infezione congenita. I risultati ottenuti, validati statisticamente, mostrano che solo nelle infezioni congenite sono presenti in maniera significativa il genotipo gN4c e il genotipo gO3, spesso in combinazione; inoltre, in tutti neonati con infezione congenita che mostravano segni clinici alla nascita era presente il genotipo gN4c, quasi in tutti nella combinazione gN4c-gO3. Altra categoria di soggetti che, come già accennato, può contrarre un’infezione da HCMV clinicamente manifesta è rappresentata dai trapiantati d’organo. In particolare, come fase propedeutica a futuri studi di genotipizzazione delle glicoproteine B, N e O quali fattori di virulenza e possibili marcatori prognostici dell’esito dell’infezione, è stata effettuata un’indagine epidemiologica retrospettiva sulla circolazione di HCMV in una coorte di soggetti trapiantati di rene in un arco temporale di cinque anni (2011-2015). L’analisi dei risultati di indagini virologiche effettuate per la diagnosi di infezione da HCMV su campioni di sangue per la determinazione dell’antigenemia e DNAemia da HCMV (compendiate dal dato anticorpale), hanno dimostrato una prevalenza e un’incidenza d’infezione con valori medi intorno al 7,5% e 3,5%, rispettivamente, per gli anni 2011, 2013, 2014, e intorno al 15% e 9%, rispettivamente, per gli anni 2012 e 2015. Inoltre, tale studio ha messo in luce come nei soggetti sottoposti a trapianto di rene, l’infezione/malattia da HCMV sia prevalentemente il risultato di un evento di riattivazione virale. Quest’ultima appare un’evenienza molto temibile e purtroppo frequente nei soggetti che, come i trapiantati d’organo, hanno un alterato stato immunitario, con possibile sviluppo di patologie non di rado mortali. In tale ottica, molti gruppi di ricerca sono ad oggi impegnati nello studio dei possibili meccanismi che regolano il passaggio dell’infezione da HCMV dalla latenza alla riattivazione. Purtroppo, gli studi di questi rilevanti aspetti, effettuati attraverso l’utilizzo di modelli cellulari sedi naturali di latenza di HCMV (in particolare, monociti del sangue periferico), sono gravemente ostacolati dalla bassa frequenza di cellule mononucleate positive (solo intorno allo 0,01%) e al loro basso contenuto di DNA di HCMV. Quanto sopra evidenziato rende pressante la necessità di utilizzare modelli monocitari umani in vitro, in cui l’infezione da HCMV coinvolga un numero maggiore di cellule rispetto a quelle reperibili in vivo, in modo da permettere una più agevole esecuzione degli studi sopra menzionati. In tale ottica, in questo studio è stato messo a punto un modello sperimentale di latenza/riattivazione dell’infezione da HCMV, utilizzando una linea monocitaria/macrofagica umana (THP-1) che sembra ricalcare gli eventi che avvengono in vivo a seguito di differenziamento dei monociti del sangue periferico, sedi di latenza, a macrofagi, veicoli di disseminazione tissutale dell’infezione. Il modello THP-1 è stato caratterizzato e validato analizzando ognuno degli stadi del ciclo di replicazione litica, a seguito di riattivazione dalla latenza, dalla replicazione del DNA virale, all’espressione dei trascritti, fino alla produzione di progenie virale. La caratterizzazione della linea THP-1 effettuata in questo studio risulta di particolare interesse in quanto offre la possibilità di eseguire, in maniera estremamente più agevole rispetto all’utilizzo del sistema naturale, lo studio dei meccanismi che regolano il passaggio dalla latenza alla riattivazione di HCMV. Per quel che riguarda tali meccanismi, è importante sottolineare che HCMV ha sviluppato molteplici strategie in grado di portare ad una significativa alterazione del metabolismo della cellula ospite, come quelle volte all’alterazione del ciclo cellulare. È evidente come l’azione di interferenza esercitata dal virus sul ciclo cellulare dipenda, oltre che da fattori virali, anche dall’interazione con circuiti metabolici e componenti della cellula ospite, cooptati da HCMV a proprio vantaggio. Tra i componenti cellulari messi di recente in evidenza in letteratura e che potrebbero giocare un ruolo di spicco nella regolazione del ciclo cellulare, sono da annoverare i micro-RNA (miRNA), che rappresentano meccanismi unici di regolazione post-trascrizionale, in grado di modulare una vasta gamma di processi biologici vitali per la cellula. Nell’ambito della moltitudine di miRNA cellulari che partecipano alla regolazione del ciclo cellulare, la famiglia miR-26 (miR-26a e miR-26b), i cui loci genici si trovano nella regione intronica del gene codificante per il gruppo di proteine CTDSP [“carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase”] denominate CTDSP1/2/L, coopera nel bloccare la transizione G1/S. È stato osservato che i miRNA 26a e 26b e le proteine CTDSP1/2/L sono espressi in concomitanza durante il ciclo cellulare e sono anche funzionalmente correlati, aumentando in fase di quiescenza (G0) e diminuendo durante la proliferazione (S). Considerando che è verosimile che l’azione esercitata da HCMV sul ciclo cellulare, osservato in cellule proliferanti come i fibroblasti MRC5 (in cui il virus blocca il ciclo cellulare in G1/S) o in cellule quiescenti come macrofagi THP-1 (che il virus spinge in fase S), possa avvalersi dell’intervento dei suddetti miRNA cellulari in sinergia con le proteine CTDSP, ci si è proposto di studiare l’espressione dei trascritti dei geni CTDSP1/2/L in cellule THP-1 infettate dal virus a diversi tempi di infezione, a confronto con le stesse cellule non infettate. I risultati ottenuti supportano il coinvolgimento dei micro-RNA 26a e 26b nella regolazione del ciclo cellulare virus-indotta, individuando in tale classe di molecole di recente scoperta, quali effettori di processi di regolazione negativa, alcuni dei possibili fattori cellulari potenzialmente coinvolti anche nel processo di riattivazione del virus dalla latenza