Characterizing the structure and function of parkin co-regulated gene protein

Parkin co-regulated gene protein (PACRG) is encoded 204 bp upstream of the Parkin gene, linked via a bi-directional promoter. Parkin is an ubiquitin ligase that regulates mitophagy and signaling pathways induced by various cellular stressors. Parkin loss-of-function mutations result in early-onset autosomal recessive Parkinson's disease (PD). First, PACRG is a component of Lewy bodies, a pathological hallmark of PD. Moreover, the quaking viable spontaneous mutant mouse, which displays neurological impairment, is a knockout of both Parkin and PACRG. Intriguingly, knockout of Parkin alone generates no apparent neurological phenotype, suggesting that PACRG has a neuroprotective role, perhaps functionally redundant with Parkin. Additionally, PACRG has been shown to generate and maintain the axoneme structure of flagella and cilia. Yet it is unclear how PACRG mediates these functions at the molecular level. Moreover, the three-dimensional structure of PACRG is unknown and it lacks known homologous domains. The objective of this thesis was to characterize the structure and molecular interactions of the PACRG protein. To this end, various expression and purification systems were tested. I have shown that full-length PACRG is unstable upon single expression in HEK293 and E. coli cells. However, deleting the non-conserved N-terminus residues generated large amounts of protein sequestered into inclusion bodies. After application of a refolding protocol, the C-terminal domain (conserved in all metazoans) bound directly to MEIG1, a protein necessary for spermiogenesis and axoneme formation. Co-expression with MEIG1 significantly increased PACRG protein yields and allowed the purification of full-length PACRG bound to MEIG1 in a 1:1 complex. This thesis thus provides a basis for future PACRG structural and functional studies. Notably, the production of recombinant PACRG will enable the study of its interactions with microtubules, thus providing insight into axoneme formation.La protéine du gène co-régulé avec Parkin (PACRG) est encodée 204 bases en amont du gène Parkin, lié via un promoteur bidirectionnel. Parkin est une ligase d'ubiquitine qui régule la mitophagie et des voies de signalisation pour différents stress cellulaires. Des mutations dans Parkin qui réduisent son activité causent une forme autosomale récessive juvénile de la maladie de Parkinson. La protéine PACRG est possiblement impliquée dans cette maladie. Tout d'abord, on la retrouve dans les corps de Lewy, une caractéristique pathologique du Parkinson. De plus, la souris mutante spontanée quaking viable, qui a des troubles neurologiques, est une délétion génétique de Parkin et PACRG. Par contre, la délétion de Parkin seule ne génère aucun phénotype neurologique apparent, ce qui suggère que PACRG a une fonction neuroprotectrice, peut-être redondante avec Parkin. De plus, PACRG est impliquée dans la formation et la maintenance de la structure axonémale que l'on retrouve dans les flagelles et les cils cellulaires. Toutefois, comment PACRG accomplit ces fonctions à l'échelle moléculaire reste inconnue. De surcroît, la structure tridimensionnelle de PACRG n'a pas été déterminée et la protéine n'a aucun domaine homologue connu. L'objectif de cette thèse est donc de caractériser la structure et les interactions moléculaires de PACRG. À cette fin, plusieurs systèmes d'expression et de purification ont été testés. J'ai démontré que la protéine PACRG entière est instable lorsqu'exprimée dans des cellules HEK293 ou E. coli. Par contre, la délétion de la portion N-terminale non-conservée génère des grandes quantités de la protéine dans des corps d'inclusions. Après une procédure de repliement, le domaine C-terminal (conservé dans tous les métazoaires) lie directement MEIG1, une protéine requise pour la spermiogénèse et la formation de l'axonème. La co-expression avec MEIG1 augmente considérablement la production de PACRG et permet la purification de la protéine PACRG entière en complexe 1:1 avec MEIG1. Cette thèse établit donc une base pour des futures études structurales et fonctionnelles de PACRG. Notamment, la production de PACRG recombinante va permettre l'étude de ses interactions avec les microtubules, fournissant ainsi des indices cruciaux sur la formation des axonèmes