Nanocontact printing on soft substrates: haptotaxis on netrin-1 digital nanodot gradients

Cellular navigation, migration, and motility are vital requirements for life, whether it beduring the development of an organism, or throughout the life cycle – for example duringtissue maintenance and wound healing. This process is regulated by continuous integrationof multiple extracellular cues. Surface bound chemical cues regulate cell navigation in manycells including neutrophils, myoblasts, and developing neurons through a process known ashaptotaxis. Mechanical cues, in the form of substrate stiffness, can also regulate cell motility,for example through a process known as durotaxis. Based on these observations, alterationsin substrate stiffness may have an impact on guided cellular migration via haptotaxis. Haptotaxis has been demonstrated on digital nanodot gradients (DNGs) of protein guidancecues, but to date these experiments have only been performed on hard surfaces. At presentthere is no existing technique to create protein patterns with nanometer scale features on softand tacky substrates. Here we present a novel technique for patterning digital nanodot gradients (DNGs) on soft substrates (E < 10 kPa). DNGs of netrin-1 (a known axon guidancecue) were patterned on Sylgard 527, a very low modulus poly(dimethylsiloxane) (PDMS).The un-patterned surface was backfilled with a reference surface of 75% poly-ethylene glycolgrafted with poly-lysine and 25% poly-D-lysine, to tune the reference cell-surface affinityand enhance the cell sensitivity to the patterned gradient. C2C12 myoblasts were culturedon the patterned substrates, and cell positions were recorded over time. Cell distributionswere observed to significantly shift towards higher density areas of netrin-1 over a time period of 18 h, signifying a haptotactic response to the patterned gradients on soft substrates.Live imaging of cells on sinusoidal gradients highlighted cells migrating and navigating by'inching'. This work represents the first time that protein patterns with feature sizes inthe nanometer range have been successfully patterned via lift-off nanocontact printing onsubstrates with stiffnesses < 10 kPa. As well, this is the first study which demonstrates ahaptotaxis migration assay on a soft substrate. This experimental technique may be usedin future projects to study haptotaxis on surfaces of varying rigidities, providing additionalinsight into how cells integrate multiple environmental signals to make navigational choices.La navigation, la motilité et la migration cellulaire sont requis pour la vie, que ce soitpendant le développent de l'organisme, ou au travers du cycle de vie – par exemple pendant laréparation du tissue et la cicatrisation. Ce processus est régulé en assimilant continuellementplusieurs signaux extracellulaire. La navigation cellulaire de plusieurs types de cellules tel lesneutrophiles, les myoblastes et les neurones en développement est régulée par l'haptotaxieou les chimioattractants et les chimiorepellants se presentent sur les surfaces. Les signauxmécaniques, comme la rigidité du substrat, peuvent aussi régulé la motilité cellulaire pardurotaxie. Il est donc possible que la rigidité du substrat ait un impacte sur la migrationcellulaire guidé par haptotaxie. Le processus de haptotaxie a été démontré sur des 'digitalnanodot gradients' (DNGs) de protéines chimioattractantes, mais ces manipulations ontseulement été faites sur des surfaces dures. Il n'y a pas de méthode existante pour produiredes motifs de protéines à l'échelle nanométrique sur des substrats mous et collants. Nousprésentons une nouvelle technique pour créer des DNGs sur des surfaces molles (E < 10kPa).DNGs de netrin-1 (un signal de guidage des axones connu) ont été crée sur du Sylgard 527,un poly(diméthylsiloxane) (PDMS) avec un coefficient d'élasticité très petit. La surfacesans motif a été remplie avec une surface référence de 75% glycol polyéthylénique grefféavec de la polylysine et 25% de poly-D-lysine, pour contrôler l'affinité des cellules pour lasurface de référence et améliorer la sensibilité de la cellule au gradient sur la surface. Lesmyoblastes C2C12 ont été mis en culture sur les substrats avec les motifs et la position descellules a été mesurée dans le temps. La distribution des cellules a été déplacée de façonsignificative vers la plus haute concentration de netrin-1 sur 18 h, signifiant une reṕonsehaptotactique au gradient imprimé sur le substrat mou. Imagerie en temps réel des cellulessur des gradients sinusoı̈dales a souligné les cellules qui migrent et naviguant au 'inching'. Cetravail est la première fois que des motifs de protéines a l'échelle nanométrique a été imprimépar un processus de 'lift-off nanocontact printing' sur des substrats avec une rigidité < 10kPa. C'est aussi la première étude qui démontre l'haptotaxie sur un substrat mou. Cettetechnique expérimentale pourra être utilisée pour l'étude de l'haptotaxie sur des surfaces avec différentes rigidités, fournissant un nouvel aperçu sur comment les cellules assimilentplusieurs signaux environnementaux pour décider leur navigation