Interaction of 'vírus do anel do pimentão' (Pepper ringspot virus - PepRSV) with plant hosts

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017.O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais hortaliças cultivadas no mundo. O cultivo de tomateiro representa uma importante atividade econômica e social no Brasil. As viroses representam um grande desafio fitossanitário para as principais regiões produtoras desta hortaliça, sendo que os begomovírus, tospovírus e crinivírus destacam-se pela importância e alta incidência. Recentemente, houve relatos de ocorrência de um tobravírus em tomateiro no Brasil e a carência de informações sobre essa virose justifica uma alta demanda para a realização de estudos sobre esse importante grupo de vírus de plantas. Representantes do gênero Tobravirus apresentam o genoma constituído por RNA senso positivo e bipartido (RNA1 e RNA2). Os tobravírus são transmitidos planta a planta por nematoides de solo e raízes dos gêneros Paratrichodorus e Trichodorus (Família Trichodoridae), considerados seus vetores naturais. Este gênero é representado por apenas três espécies, Tobacco rattle virus (TRV), Pea early-browning virus (PEBV) e Pepper ringspot virus (PepRSV). Conhecido como vírus da mancha anelar do pimentão ou vírus da faixa amarela do tomateiro, o PepRSV foi descrito somente no Brasil, causando doenças nas culturas de pimenta, alcachofra, patchuli e tomate. O primeiro isolado a ser caracterizado foi proveniente de pimenta e é conhecido como isolado CAM (Campinas-SP). Em 2012, a ocorrência de dois isolados de PepRSV foi relatada em tomateiro rasteiro em Luziânia, GO, denominados LAV e Pivo4. O objetivo geral deste trabalho foi estudar a interação de PepRSV com plantas hospedeiras e construir clones infecciosos de PepRSV (isolado CAM e LAV). Dois isolados foram utilizados, CAM de pimentão e LAV, isolado de tomateiro. Inicialmente, estes isolados foram caracterizados biologicamente e um antissoro foi produzido (cap. 2). Adicionalmente, clones infecciosos foram construídos (cap. 3). No capítulo 2, o círculo de hospedeiro foi analisado a partir inoculação mecânica em plantas indicadoras e cultivares de tomateiro. Partículas virais foram purificadas visando a produção de anticorpos em coelhos. A presença das partículas purificadas foi confirmada em microscópio eletrônico de transmissão e o antissoro anti-CP foi produzido. No capítulo 3, descreve-se a construção de clones infeciosos de PepRSV isolado CAM e LAV através da extração de RNA total, seguido por uma RT-PCR do RNA1 e RNA2 que foram inseridos no vetor de clonagem pJL-89 por Gibson Assembly. Os clones de PepRSV (isolado CAM e LAV) gerados foram agroinfiltrados em plantas de N. benthamiana. Conclui-se com esse trabalho que foi possível a produção do antissoro policlonal anti-CP que foi utilizado como técnica de detecção sorológica para determinar o círculo de hospedeiros do isolado CAM de PepRSV (infectou sistemicamente 16 plantas distintas); PepRSV isolado CAM se transloca para o sistema radícular quando inoculado na parte aérea das hospedeiras Nicotiana tabacum ‘Samsun’, N. tabacum ‘TNN’, N. rustica, Capsicum chinense PI159236, C. annuum ‘Ikeda’, S. lycopersicum cv. Santa Clara, Chenopodium quinoa e Gomphrena globosa; as cultivares de tomateiro Santa Clara, AP533, N901, U2006, Money Maker e Gaucho são suceptíveis à infecção por PepRSV isolado CAM; foi detectado um novo isolado de PepRSV denominado Ag1. Finalmente, os clones infeciosos de dois isolados construídos se mostraram infectivos em plantas de N. benthamiana, viabilizando a realização de estudos aprofundados de replicação, transmissão e translocação.The tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the main vegetables grown in the world. The cultivation of tomato represents an important economic and social activity in Brazil. Viruses represent a major phytosanitary problem for the major growing regions of this vegetable, being the begomovirus, tospovirus and crinivirus the ones with great importance and high incidence. Recently, there were reports of the occurrence of a tobravirus in Brazil and the lack of information about this virus disease justifies a high demand on starting a research on this important virus group. Members of the genus Tobravirus have the genome constituted by positive sense RNA in a bipartite genome (RNA1 and RNA2). Tobraviruses are transmitted plant-by-plant by soil nematodes of the genus Paratrichodorus and Trichodorus (family Trichodoridae), considered as their natural vectors. This genus is represented by only three species, Tobacco rattle virus (TRV), Pea early-browning virus (PEBV) and Pepper ringspot virus (PepRSV). Known as ‘vírus da mancha anelar do pimentão’ or ‘vírus da faixa amarela’, PepRSV is only described in Brazil, causing diseases in pepper, artichoke, patchuli and tomato plants. The first isolate characterized was from pepper and is known as isolate CAM (Campinas-SP). In 2012, the occurrence two isolates of PepRSV was reported in processing tomatoes in Luziânia, GO, denominated LAV and Pivo4 . The general objective of this work was to study the interaction of PepRSV with the host. Two isolates were used, CAM from pepper and LAV, collected in tomato in 2012. Initially, these isolates were characterized biologically and an antibody was produced (Chapter 2). Furthermore, infectious clones were constructed (Chapter 3). In the chapter 2, the host range was analyzed afer mechanical inoculation in indicator plants, and tomato cultivars. Viral particles were purified for the production of antibodies in rabbits. The presence of the purified particles was confirmed by transmission electron microscopy, and an atibody with good specificity was produced. In the chapter 3, PepRSV infectious clones were constructed by extracting total RNA, followed by an RNA-1 and RNA2 RT-PCR that were inserted into the pJL-89 cloning vector by Gibson Assembly and later were agro-infiltrated into susceptible plants. It was concluded that it was possible to produce anti-CP polyclonal antibody; the PepRSV CAM isolate infects 16 different plants systemically; PepRSV isolate CAM translocates to the root system when inoculated on the aerial part of the hosts Nicotiana tabacum 'Samsun', N. tabacum 'TNN', N. rustica, Capsicum chinense PI159236, C. annuum 'Ikeda', S. lycopersicum cv. Santa Clara, Chenopodium quinoa and Gomphrena globosa; the tomato cultivars AP533, N901, U2006, Money Maker and Gaucho were susceptible to infection by PepRSV isolated CAM; a new PepRSV isolate named Ag1 was detected; and finally the clones of PepRSV were infectious to N. benthamiana plants