Study of the interference of organic substrates in the action of ozone on deteriorating, beneficial and pathogenic microorganisms

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-graduação em Ciências Animais, 2016.A utilização do ozônio na indústria de alimentos é alvo de pesquisas desde que o composto foi considerado seguro por associações internacionais como a FDA (Food and Drug Administration), com efetiva ação contra bactérias Gram positivas e Gram negativas, fungos e vírus. Essa pesquisa foi conduzida em duas etapas que objetivaram avaliar a interferência de substratos orgânicos na ação do ozônio sobre microrganismos deteriorantes e benéficos, a eficácia do ozônio e da água ozonizada refrigerada sobre patogênicos. Na primeira adotaram-se como substratos orgânicos, leites com diferentes composições (integral homogeneizado com lactose, integral homogeneizado sem lactose, desnatado homogeneizado com lactose, desnatado homogeneizado sem lactose integral sem homogeneização) que foram inoculados com cepas de Escherichia coli (ATCC® 11229™) e Lactobacillus sakei subsp. sakei (ATCC® 15524™); também, avaliou-se a água como um substrato parâmetro de comparação. O gás ozônio foi utilizado nas concentrações de 21 e 31 mg/L por períodos de exposição de 0, 5, 15 e 25 min. Na segunda etapa, foi avaliado o efeito da aplicação direta (gás) e indireta (água ozonizada) do ozônio sobre Escherichia coli O157:H7 (ATCC® 43890™); na aplicação direta utilizou-se os mesmos substratos, concentrações de ozônio e períodos de exposição da primeira etapa. Para a obtenção da água ozonizada, a concentração utilizada do gás foi de 31 mg/L e o período de exposição de 15 min; adotou-se um período de contato de 5 min do inóculo com a água ozonizada que era mantida estocada sob refrigeração (7oC ±1oC) por 0; 0,5; 1,0; 1,5; 3,0 e 24 h. Em ambas as etapas o efeito do ozônio foi determinado por meio das contagens dos microrganismos inoculados, antes e após a ozonização. Para as contagens de E. coli utilizou-se o sistema Petrifilm™ EC; para contagens de Lb. sakei utilizou-se o ágar De Man Rogosa e Sharpe (MRS) e, para E. coli O157:H7 foi utilizado o ágar Violet Red Bile (VRB). Por fim, buscou-se observar possíveis alterações das características físico-químicas dos leites submetidos à ozonização. Aplicou-se o Delineamento Inteiramente Casualizado, com três repetições. Na primeira etapa verificou-se que a composição do substrato interfere na ação do ozônio sobre as contagens de E. coli e Lb. sakei. Observou-se que as maiores reduções nas contagens desses microrganismos ocorreram quando em água e em leite desnatado homogeneizado sem lactose. Em água, tanto para E. coli quanto para Lb. sakei, as reduções médias nas contagens foram maiores que 3 ciclos log, em todas as combinações de concentração do gás e período de exposição. Quando o substrato foi leite desnatado homogeneizado sem lactose, as reduções nas contagens de E. coli, independentemente do tempo, permaneceram entre 3,1 e 3,36 ciclos log, enquanto que para Lb. sakei, a maior redução foi de 1,49 ciclos log e na concentração de 31 mg/L por 25 min. No substrato leite integral homogeneizado, as reduções na contagem de Lb. sakei foram inferiores a 0,1 ciclo log. Na segunda etapa, também se constatou que a ação do ozônio sobre E. coli O157:H7 foi influenciada pela composição dos substratos. No leite desnatado homogeneizado sem lactose foram obtidas reduções de 1,53 e 1,54 ciclos log para períodos de exposição de 25 min. nas concentrações de 21 e 31 mg/L, respectivamente. Nos substratos leite integral homogeneizado com lactose e leite desnatado homogeneizado com lactose, as reduções nas contagens de E. coli O157:H7 foram inferiores a 0,40 ciclo log, em ambas as concentrações de ozônio e em todos os períodos de exposição ao gás. Já na avaliação da eficiência da água ozonizada sobre E. coli O157:H7 os resultados mostraram redução média de aproximadamente, 4,5 ciclos log em todos os ensaios realizados. Não foram observadas alterações significativas nas características físico-químicas nos diferentes leites submetidos à ozonização. Os resultados dessa pesquisa permitem concluir que substratos orgânicos gordura e lactose, como os principais componentes do leite, interferem na ação do ozônio sobre E. coli e E. coli O157:H7 diminuindo a sua eficácia como sanitizante e reforçando a necessidade de remoção adequada de matéria orgânica nos processos de limpeza. Por outro lado, as baixas reduções nas contagens de Lb. sakei indicam que o seu desenvolvimento é pouco afetado pelo ozônio, quando inoculado em substratos orgânicos. A água ozonizada refrigerada por até 24 h é eficaz no controle de E. coli O157:H7, podendo representar uma alternativa a outros sanitizantes. E por fim, a aplicação de ozônio no leite, nas concentrações avaliadas, não causa alterações importantes nas características físico-químicas do leite de vaca de diferentes composições.The use of ozone in the food industry has been the subject of research since the compound was considered safe by international associations such as an FDA, with effective action against Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi and viruses. This research was conducted in two stages that aimed to evaluate an interference of organic substrates in the action of ozone on a deteriorating and beneficial microorganism and an efficacy of refrigerated ozonated water on pathogens. In the first stage, organic milk substrates (lactose homogenized homogenate, lactose-free homogenized skim milk, lactose homogenized skim milk, lactose-free homogenized skim milk and whole without homogenization) were used as organic substrates and were inoculated with strains of Escherichia coli 11229 ™) and Lactobacillus sakei subsp. Sakei (ATCC® 15524 ™); Also, water was evaluated as a substrate parameter for comparison. Ozone gas was used at concentrations of 21 and 31 mg / L for periods of exposure of 0, 5, 15 and 25 min. In the second stage, the effect of direct and indirect ozone application on Escherichia coli O157:H7 (ATCC® 43890 ™) was evaluated; the direct application consisted of applying the same substrates, ozone concentrations and exposure periods according to the first step. To obtain ozonated water, the gas concentration was 31 mg / L and the exposure period was 15 minutes. A 5-minute contact period was used to evaluate the efficacy of ozonated water stored under refrigeration (7°C ± 1°C) by 0; 0,5; 1,0; 1,5; 3,0 and 24 h in the control of E. coli O157: H7. In both stages the ozone effect was determined by the counts of the inoculated microorganisms, before and after the ozonation. For the counts of E. coli the Petrifilm ™ EC system was used; For Lb. sakei counts. (MRS) and E. coli O157:H7, the Violet Red Bile agar (VRB) was used. Finally, it was possible to observe possible changes in the physical-chemical characteristics of the milks submitted to ozonization. A completely randomized design was used, with three replicates. In the first step it was found that the substrate composition produces effects on ozone action on E. coli and Lb. Sakei counts. It was observed that the greatest reductions in the counts of these microorganisms occurred when in water and skim milk homogenized without lactose. In water, for both E. coli and Lb. sakei, mean counts reductions were greater than 3 log cycles in all combinations of gas concentration and exposure period. When the substrate was non-lactose homogenized skim milk, the reductions in E. coli counts, regardless of the time, remained between 3,1 and 3,36 log cycles, whereas for Lb. Sakei, the largest reduction was 1,49 log cycles and the concentration of 31 mg/L for 25 minutes. And when the substrates for homogenized whole milk, such as reductions in Lb. sakei count were less than 0,1 log cycle. In the second step, it was also found that an ozone action on E. coli O157:H7 was influenced by the composition of the substrates. In non-lactose homogenized skim milk, reductions of 1,53 and 1,54 log cycles were obtained for 25 minutes exposure periods. At concentrations of 21 and 31 mg / L, respectively. On the substrates homogenized milk with lactose and skim milk homogenized with lactose, the reductions in the counts of E. coli O157: H7 were lower than 0,40 log cycles, in both the concentration of ozone and in all periods of exposure to the gas. In the evaluation of the ozonated water efficiency on E. coli O157:H7 the results showed an average reduction of approximately 4,5 log cycles in all tests performed. No significant changes were observed in the physicochemical characteristics of the different milks submitted to ozonization. The results of this research allow us to conclude that organic substrates, such as the main components of milk, interfere with the action of ozone on E. coli, and E. coli O157:H7 decreasing its effectiveness as a sanitizing agent and reinforcing the need for adequate removal of organic matter cleaning processes. On the other hand, the low reductions in Lb. sakei indicate that their development is poorly affected by ozone when inoculated on organic substrates. The refrigerated ozonated water for up to 24 hours is effective in the control of E. coli O157:H7, and may represent an alternative to other sanitizers. Finally, the application of ozone in milk, at the concentrations evaluated, does not cause important changes in the physical-chemical characteristics of cow's milk of different compositions