Desenvolvimento de uma nanoformulação com alumínio-cloro-ftalocianina e paromomicina para tratamento da leishmaniose

Tese (Doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia, 2016.A leishmaniose é um problema de saúde pública em países em desenvolvimento. O tratamento dessa doença baseia-se principalmente no uso de antimoniais pentavalentes, em casos de falha terapêutica drogas como o Pentostam e a Anfotericina B tem sido utilizadas. Entretanto, a elevada toxicidade desses compostos e a geração de resistência a eles tem limitado o tratamento dessa doença, o que sugere o desenvolvimento de terapias mais efetivas. Por isso, realizou-se esta tese cujo objetivo principal consistiu no desenvolvimento de uma nanoformulação contendo o fotossensibilizante Alumínio-Cloro-Ftalocianina e o antibiótico Paromomicina para ser utilizada no tratamento da Leishmaniose Cutânea por meio de Terapia Fotodinâmica. A nanoemulsão O/A de AlClFt e Paromomicina foi preparada por meio do método de emulsificação espontânea, sendo que depois de caracterizada e ter a sua estabilidade determinada, o sistema de nanoemulsão foi testado quanto a capacidade de apresentar efeito antiparasitário em promastigotas, amastigotas intracelulares de L. braziliensis e células THP-1 diferenciadas, antes e depois da Terapia Fotodinâmica (5 joules/cm2) durante 24 horas; os resultados foram expressos como percentagens de inibição e concentração inibitória 50 e 90 (CI50, CI90) e como concentração citotóxica 50 e 90 (CC50 e CC90). Além disso, determinou-se ex vivo, em pele de camundongos Balb/c, a capacidade de permeação e de retenção dos sistemas de nanoemulsão mediante o sistema de células de Franz e tape stripping, respetivamente. Adicionalmente, camundongos Balb/c foram tratados topicamente na base da cauda com os nanoconjugados durante 15 dias usando terapia fotodinâmica, após de seis dias do término do tratamento; fígado, pele, baço e rim foram extraídos para a análise da biodistribuição da AlClFt e PM por espectrofluorometria e cromatografia líquida de alto desempenho, respetivamente. Além disso, medula óssea dos camundongos foi analisada para avaliação de formação de micronúcleos nos eritrócitos policromatófilos; sangue intracardíaca foi extraído para análise hemograma. Os resultados mostraram sistemas de nanoemulsão O/A com diâmetros hidrodinâmicos 90% do crescimento de promastigotas e amastigotas intracelulares de L. braziliensis após da terapia fotodinâmica em concentrações onde não foi observado toxicidade nas células hospedeiras, mostrando seletividade. Por outro lado, em ex vivo e in vivo, a AlClFt não foi capaz de permear a pele de camundongos Balb/c. Já a PM no nanoconjugado, permeou até 86 vezes mais do que a PM livre após de 6 horas em sistemas ex vivo. A PM acumulou-se mais no baço. Os sistemas de nanoemulsão não foram genotóxico, tampouco causaram irritabilidade, vermelhidão e laceração durante e após do tratamento tópico. A análise do hemograma mostrou diminuição na contagem de plaquetas da maioria dos camundongos, as outras células do sangue não foram alteradas. Estes resultados, além de originais, propõem um nanoconjugado promissor para ser utilizado no modelo murino de Leishmaniasis cutânea.Leishmaniasis is still a public health problem in developing countries, which have morbidity on the increase. Pentavalent antimonials are still the mainstay of treatment, although in cases of therapeutic failure, another drugs such as Pentostan, and Amphotericin B, among others, are considered. However, the effectiveness of this therapy is limited due to its high toxicity, the emergence of acquired resistance, route of administration and prolonged lenght of therapy. For the above, the search for new drugs is a focus in investigation, actually. In order to formulate an alternative antileishamanial therapy, in this thesis is proposed the use of nanobiotechnology to optimize the combined effect of photodynamic therapy with aluminiumphthalocyanine chloride (AlClFt) and Paramomycin (PM), an antibiotic used to the treatment of the leishmaniasis in the Old world. If this nanoconjugate is active against the parasite, is not toxic and its nanoconjugated are able to penetrate layers of skin of mices, it could be used as a murine model of cutaneous leishamaniasis, in subsequent studies. According to above, the main objective of this thesis was to develop a nano-formulation of aluminium-phthalocyanine chloride and Paramomicyn for the treatment of cutaneous leishmaniasis using photodynamic therapy.The oil/water (O/W) nanoemulsion of AlClFt and Paramomycin was prepared using the spontaneous emulsification method. Also, nanoemulsions with each individuals compounds and vehicles were prepared. The colloidal characterization of theses nanosystems was made by measuring the hydrodynamic diameter and determining polydispersity index and zeta potential by dynamic light scattering and electrophoretic mobility, respectively. Furthemore, physicochemical caracterization was performed to determine the absorption and emission spectra (excited 350nm) of AlClFt present in the nanosystem. pH, reactive oxygen species and stabylity at 4ºC during four months were also determined. Promastigotes and intracelular amastigotes of Leishamania braziliensis and differentiated tHP-1 cells were treated with each of different nanoemulsion systems, before and after photodynamic therapy (5 joules/cm2), during 24 hours. The results were expressed as inhibition percents and 50 and 90% inhibitory concentration (IC50 and IC90). Permeability and ex vivo retention in skin of Balb/c mice of nanoemulsions were tested by Franz cells and tape stripping systems, respectively. In addition, Balb/c mice were treated topically with the nanoconjugates during 15 days. 6 days after treatment finished, liver, skin, spleen and kidney were extracted in order to analyze the AlClFt and PM biodistribution by spectrophotometry and High performance liquid cromatography (HPLC), respectively. Also, bone marrow of mice was analyzed to detect micronucleous in polychromatic erithrocytes. It was obtained intracardiac blood to hematologic analysis. The O/W nanoemulsion systems showed hydrodynamic diameters 90% of promastigotes and intracellular promastigotes of L. braziliensis after photodynamyc therapy using no toxic concentrations for host cells, showing selectivity. Moreover, In ex vivo and in vivo systems, AlClFt did not able to penetrate a skin of Balb/c mice while PM nanoconjugate penetrate 86 fold more than PM free, after 6 hours in ex vivo systems. In vivo assays, concentrations up 292.96M were detected in spleen of treated animals. The nanoemulsion system did not show genotoxicity neither irritability, redness nor tearing during and after topic treatment. Decreased platelet count was recorded in most of mice. Another blood cells were not altered. These results suggest a promissory nanoconjugate to be used in the murine model of cutaneous Leishmaniasis