Development, validation, transferability and application of microsatellite markers in genetic studies of passifloras

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2016.O gênero Passiflora compreende centenas de espécies silvestres e cultivadas de maracujá que possuem diversos usos na alimentação, na indústria, na medicina e também no paisagismo. Esforços para desenvolver ferramentas de análises genéticas em Passiflora edulis Sims, a espécie mais importante do gênero Passiflora, ainda são incipientes. Nessa pesquisa, é descrito o uso do Sequenciamento de Nova Geração para a montagem parcial do genoma de P. edulis com o intuito de desenvolver centenas de novos marcadores microssatélites. Um total de 14,11 Gpb de reads de sequências paired-end de Illumina foram analisadas para detectar sequências simples repetidas no genoma de maracujá. Uma amostra de 1.300 contigs que continham sequencias de microssatélites foram selecionadas para o desenvolvimento de primers para PCR. Os painéis para os marcadores di- e trinucleotídeos selecionados, foram testados em acessos de P. edulis para a sua validação. Polimorfismo foi detectado em 74% dos marcadores (PIC=0,16-0,77; número de alelos/loco=2-7). Os marcadores mais polimórficos (PIC=0,46-0,77) foram usados em análises de transferibilidade, modo de reprodução e confirmação de cruzamentos. Os marcadores foram testados em 78 espécies de Passiflora, onde aproximadamente 71% da combinação marcador/espécie foi positiva para a amplificação em todas as espécies testadas. No estudo do modo de reprodução da cultivar BRS Maracujá Jaboticaba de P. edulis, nas populações de polinização aberta, a taxa de cruzamento multiloco (tm) variou entre 0,409 e 0,566, evidenciando modo de reprodução misto por meio de autogamia e alogamia. Na confirmação de cruzamentos, foram analisados os genitores de quatro genealogias para a Inclusão ou Exclusão Categóricas para cada loco, e então calculados os Índice de Paternidade (PI) e a Probabilidade de Paternidade (W) para os verdadeiros genitores. Os marcadores microssatélites testados auxiliaram na exclusão de 7 supostos genitores de 6 cruzamentos em 4 genealogias, e confirmaram como genitores verdadeiros 5 dos supostos genitores, onde W variou entre 95,137 e 99,999%. Nossos estudos confirmaram a obtenção dos híbridos sexuais do cruzamentos interespecífico P. edulis GA2 x P. incarnata. Os marcadores moleculares microssatélites desenvolvidos, validados e utilizados nesse trabalho serão de grande utilidade para diferentes estudos genéticos das Passifloras por diferentes grupos de pesquisa no Brasil e no mundo.The Passiflora genus comprises hundreds of wild and cultivated species of passion fruit used for food, industrial, ornamental and medicinal purposes. Efforts to develop genomic tools for genetic analysis of P. edulis, the most important of the Passiflora species, are still incipient. We describe the use of NGS technology to partially assemble the P. edulis genome in order to develop hundreds of new microsatellite markers. A total of 14.11 Mbp of Illumina pairedend sequence reads were analyzed to detect simple sequence repeat sites in the sour passion fruit genome. A sample of 1,300 contigs containing perfect repeat microsatellite sequences was selected for PCR primer development. A panel of di- and tri-nucleotide repeat markers selected were then tested in P. edulis germplasm accessions for validation. DNA polymorphism was detected in 74% of the markers (PIC= 0.16 to 0.77; number of alleles/locus= 2 to 7). A core panel of highly polymorphic markers (PIC= 0.46 to 0.77) was used in analysis of cross-amplify, matting system and confirmation crosses in Passiflora. The markers tested in 78 species of Passiflora resulted in 71% of the marker/species combinations for positive amplicons in all species tested. In the study of matting system in the cultivar BRS Maracujá Jaboticaba of P. edulis, in three of the offspring that comes from commercial orchards of P. edulis allogamy were confirmed with multilocus outcrossing rate (tm) 0,409 to 0,566, that is an evidence of the mixed mating system through autogamy and allogamy. For the confirmation of crosses we analyzed the genitors from crosses of four genealogies by Categorical Inclusion or Exclusion for each loci, and then, estimated the Paternity Index (PI) and the Probability of Paternity (W) for the true genitor. Microsatellite markers tested assist for the exclusion of 7 alleged genitors of 6 crossings in 4 genealogies, and confirmed as a true genitors 5 alleged genitors, where W was rated between 95.137 and 99.999%. Our research confirms the achievement of sexual hybrid for interspecific crossing of P. edulis GA2 x P. incarnata. The new microsatellite markers, validated and used in this research, will be useful for different genetic studies of Passiflora by different research groups in Brazil and worldwide