Morphological, enzymatic and molecular characterization of brazilian populations of meloidogyne spp. : species identification and synonymization

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016.Os nematoides-das-galhas são classificados no gênero Meloidogyne e estão amplamente distribuídos ao redor do mundo com mais de 100 espécies descritas e mais de 2000 espécies hospedeiras, representando ameaça à produção agrícola mundial. A identificação precisa e acurada das espécies é de extrema importância para o controle efetivo das doenças causadas por esses organismos. A taxonomia do gênero Meloidogyne no passado, geralmente era baseada em caracteres morfológicos e biométricos, e as vezes citológicos. No entanto, a variabilidade dos padrões perineais e dos caracteres morfológicos diagnósticos, variações na biometria e cromossomos muito pequenos, muitas vezes difíceis de se observar e de se contar, constituem até aos dias de hoje, limitações que tornam a identificação específica difícil, até para os taxonomistas mais experientes. Por isso, faz-se necessário a integração dos métodos clássicos de identificação com as técnicas mais modernas, como o uso dos marcadores enzimáticos e moleculares, que corroborem para uma identificação específica mais precisa. Neste trabalho, são apresentados os resultados dos estudos da diversidade genética de populações brasileiras de Meloidogyne spp. recentemente descritas, em comparação com espécies comumente encontradas no Brasil. É feita também, a sinonimização de M. brasiliensis com M. ethiopica, com base em estudos enzimáticos (perfil de esterase), marcadores SCAR espécie – específicos, sequênciamento das regiões ITS1-5.8S-ITS2 e fragmento D2-D3 do rRNA, e uma análise comparativa das descrições originais de ambas espécies. Além disso, é feito também, o primeiro relato de M. konaensis no Brasil e comparação com M. paranaensis. Das cinco espécies de Meloidogyne descritas no Brasil nas últimas duas décadas, tradadas como espécies brasileiras de Meloidogyne (M. petuniae, M. brasiliensis, M. pisi, M. phaseoli e M. polycephannulata), quatro delas foram descritas apenas com base em caracteres morfológicos e morfométricos. Essas espécies foram submetidas a análises adicionais com marcadores bioquímicos e moleculares. Análises de isoenzimas realizadas com essas espécies revelaram novos padrões de esterase para M. petuniae (Est Pe2 Rm: 0,95, 1,1) e M, pisi (Est Pi5 Rm: 0,85, 0,90, 1,0, 1,25, 1,30). M. brasiliensis, M. phaseoli e M. polycephannulata, apresentaram padrões de esterases idênticos aos padrões de espécies anteriormente descritas como, M. ethiopica (Est E3 Rm: 0,9, 1,05, 1,20), M. morocciensis (Est A3 Rm: 1,1, 1,2, 1,3) e M. incognita (Est I1 Rm: 1,05, 1.1), respectivamente. Marcadores SCAR espécie-específicos desenvolvidos para M. ethiopica, M. phaseoli e M. morocciensis, e, testados paras as espécies brasileiras cujos padrões de esterase tinham sido idênticos ao dessas espécies, resultou na amplificação de um único produto de 350 pb para populações de M. ethiopica e M. brasiliensis, 420 pb para populações de M. morocciensis e M. phaseoli, e 399 pb para M. incognita e M. polycephannulata, corroborando com os padrões de esterase. O estudo da variabilidade genética dentro desses grupos foi realizado com utilização de 30 primers RAPD e 11 AFLP, e os resultados revelaram níveis de polimorfismos médios entre as populações dessas espécies, sendo 40,7% de polimorfismo nas populações de M. ethiopica e M. brasiliensis, 43,6% em populações de M. morocciensis e M. phaseoli e 34.7% em populações de M. incognita e M. polycephannulata. No entanto, populações de M. ethiopica e M. brasiliensis, M. morocciensis e M. phaseoli, e M. incognita e M. polycephannulata se agruparam entre si em dendograma obtido a partir das análises desses marcadores com suporte de bootstrap de 77%, 100% e 100%, respectivamente. Meloidogyne brasiliensis foi sinonimizado com M. ethiopica, com base em estudos comparativos das descrições de ambas espécies e estudo da proximidade genética entre elas, baseados em análise com marcadores enzimáticos e SCAR espécie – específicos e sequênciamento das regiões ITS1-5.8S-ITS2 e D2-D3 (28S) do rRNA. Finalmente, M. konaensis, descrita pela primeira vez a partir de espécimes coletadas em solos provenientes de áreas cultivadas com café (Coffea arabica) na Ilha do Kona, Hawai, foi relatada pela primeira vez no Brasil em plantas de repolho, mamão, noni e canapum, no estado do Ceará. Estudos morfológicos mostraram características típicas de M. konaensis. O padrão de esterase K3 é finalmente caracterizado como espécie-específico para essa espécie, com três bandas principais de Rm: 1,0, 1,17, 1,27 e uma banda secundária Rm: 1,10. Alguns equívocos acerca da verdadeira identidade de M. konaensis são esclarecidos neste estudo, incluindo as suas diferenças com M. paranaensis.The root-knot-nematodes are classified in the genus Meloidogyne, and are widely distributed around the world with more than 100 described species and more than 2000 hosts, representing threat worldwide to agriculture. Accurate and precise species identification is very important for effective control of diseases caused by these organisms. The taxonomy of the genus Meloidogyne years ago, was generally based on morphological and biometric characters, and sometimes cytological. However, variability of the perineal patterns and diagnostic morphological characters, variations in biometrics and small chromosomes, often difficult to be observed and counted, are up to today, limitations that make it difficult or impossible to specific identification, even for experienced taxonomists. Therefore, the integration of classical methods of identification with modern techniques such as the use of enzymatic and molecular markers is necessary to a more accurate and reliable specific identification. In this work, we present the results of the study of genetic diversity of Brazilian populations of Meloidogyne spp. recently described, compared with previously identified species. Meloidogyne brasiliensis was synonymized with M. ethiopica. Moreover, Meloidogyne konaensis is reported here for the first time in Brazil. The five Meloidogyne species described in Brazil in the last two decades, treated as Brazilian species (M. petuniae, M. brasiliensis, M. pisi, M. phaseoli and, M. polycephannulata), four of which were described based only on morphological and morphometric characters. In this study, these species were subjected to further analysis with biochemical and molecular markers. Isoenzyme analysis performed with these species revealed new patterns of esterase for M. petuniae (Est Pe2 Rm: 0.95, 1.1) and M. pisi (Est Pi5 Rm: 0.85, 0.90, 1.0, 1.25, 1.3). Meloidogyne brasiliensis, M. phaseoli and M. polycephannulata showed esterase patterns very similar to the patterns of previously existing species as M. ethiopica (Est E3 Rm: 0.9, 1.05, 1.20), M. morocciensis (Est A3 Rm: 1.1, 1.2, 1.3) and M. incognita (Est I1 Rm: 1.05, 1.1), respectively. Species-specific SCAR markers developed to M. ethiopica, M. morocciensis and M. incognita and tested for these group of species, resulted in amplification of a single 350 bp product for M. ethiopica and M. brasiliensis populations, 420 bp for M. morocciensis and M. phaseoli populations, and 399 bp for M. incognita and M. polycephannulata populations, corroborating with the esterase patterns. The study of genetic variability within these groups was carried out using 30 RAPD primers and 11 AFLP, and the results showed relatively medium levels of polymorphism between populations of these species, 40.7% polymorphism within populations of M. ethiopica and M. brasiliensis, 43.6% in M. morocciensis and M. phaseoli populations and 34.7% in M. incognita and M. polycephannulata populations. However, populations of M. ethiopica and M. brasiliensis; M. morocciensis and M. phaseoli; M. incognita and M. polycephannulata clustered together in the same clade in dendrogram obtained from the analysis of these markers with 77%, 100% and 100% bootstrap support, respectively. Meloidogyne brasiliensis described and illustrated from specimens collected from tomato and pea plants based only on the morphology and morphometry, now is synonymized with M. ethiopica based on comparative studies of descriptions of both species and genetic study of the similarities between them, based on analysis of enzymatic markers, species – specific SCAR and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2 regions and D2-D3(28S) rRNA. Finally, M. konaensis, first described in soil cultivated with coffee plants in Kona Island, Hawaii, is now reported for the first time in Brazil, parasitizing plants of cabbage, papaya, noni and canapum in Ceará state. Morphological studies showed typical characteristics for the species M. konaensis. The esterase pattern K3 is unique and species-specific with three major bands (Rm: 1.0, 1.17, 1.27) and a secondary band (Rm 1.10). Confusion on the real identity of this species is clarified in this study, including the differentiation from M. paranaensis. Pathogenicity tests indicated that coffee is not a host of M. konaensis as previously reported in the original description of this species