Análise do impacto da deleção do gene p94 (ac134) de autographa californica multiple nucleopolyhedovirus

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós Graduação em Biologia Molecular, 2015.Os baculovirus são um grupo de vírus de inseto com genoma grande de DNA fita dupla, cuja infecção primária é desencadeada por um vírion envelopado denominado vírus derivado da oclusão (do inglês: occlusion derived virus - ODV) embebido em um corpo de oclusão (do inglês, occclusion body- OB) formado por uma matriz proteica cristalina. Cada vírion pode conter um (SNPV) ou mais nucleocapsídeos (MNPV) por envelope, dependendo da espécie viral. A base genética deste fenótipo não foi identificada e há correlação deste fenótipo com a filogenia de baculovirus não foi estabelecida. Contudo, alguns baculovirus intimamente relacionados, como o BmNPV, BomaNPV-S2 e AcMNPV possuem fenótipos discordantes e podem ajudar a identificar possíveis genes responsáveis pelo múltiplo envelopamento. Portanto, nós comparamos os genomas desses vírus e identificamos um único gene presente em BomaNPV e AcMNPV e ausente em BmNPV. Esse gene é a diferença mais significativa entre esses genomas. Para avaliar se esse gene estava relacionado com o fenótipo MNPV nós construímos três baculovirus recombinantes: vAc-polh-p94-del (p94 deletado), vAc-polh-p94-ha-rep (p94 reparado com uma tag -HA) e vAc-polh (controle). Nós mostramos que a P94 é detectada a 6 h.p.i no citoplasma de células infectadas com acumulação máxima a 24 h.p.i.. A deleção completa do gene p94 no genoma do AcMNPV causou um retardo na replicação do DNA, na produção de BV, na expressão de IE1 e, a produção de OBs é diminuída. Entretanto, o fenótipo MNPV não foi alterado. Desta forma, o gene p94 de AcMNPV não é um gene essencial para replicação e estabelecimento da infecção viral e sua aquisição no genoma do AcMNPV provavelmente proporcionou ao vírus uma vantagem seletiva.The baculoviruses are a group of insect viruses with large dsDNA genomes, and their primary infection is triggered by rod-shaped enveloped virions (ODV) embedded in a crystalline protein matrix. Each virion may contain single (SNPV) or multiple nucleocapsids (MNPV) within an envelope, depending on the viral species. The genetic basis of this phenotype has not been identified and it does not seem to be correlated with baculovirus phylogeny. However, some closely related baculoviruses, such as BmNPV, BomaNPV and AcMNPV, have discordant phenotypes and may help to identify candidate genes. Therefore, we compared the genome of these viruses and found a unique gene (p94) that was present in BomaNPV and AcMNPV and was absent in BmNPV. This gene was the most significant difference among the BmNPV and the BomaNPN and AcMNPV genomes. To analyze whether this gene was related to the MNPV phenotype we constructed three recombinant baculoviruses: vAc-pol-p94-del (p94 disrupted), vAc-pol-p94-ha-rep (p94 repaired with -HA tag) and vAc-pol (control). We found that the P94 was detected at 6 h post-infection (p.i.) in the cytoplasm of infected cells with maximum accumulation at 24 h p.i. The lack of complete p94 gene (including the exclusion of the origin of DNA replication located there) in the AcMNPV genome resulted in a delay in DNA replication, BV production and IE1 expression. OB production in vitro was also decreased. Moreover, the ODV nucleocapsid envelopment was not chanced. Therefore, the p94 gene of AcMNPV is not an essential gene for viral DNA replication and establishment of viral infection. Its acquisition in some baculoviruses genomes might give a selective advantage for the virus