O papel do inflamassoma na infecção induzida pelas formas saprofíticas do fungo Fonsecaea pedrosoi

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016.O Fonsecaea pedrosoi é um fungo dimórfico e o principal agente etiológico da cromoblastomicose, infecção crônica da pele e tecidos subcutâneos iniciada pela inoculação transcutânea das formas saprofíticas do fungo. No hospedeiro, essas células transformam-se em células muriformes, tida como a forma parasítica do fungo e grandes produtoras de melanina, considerada um importante fator de virulência. Estudos recentes têm proposto que a cronicidade da cromoblastomicose decorre de falhas, tanto no reconhecimento inato do fungo, levando à baixa produção de citocinas pró-inflamatórias, quanto na montagem de uma resposta imune adequada para a contenção da infecção. Nesse contexto, considerando o inflamassoma como um importante sistema de reconhecimento inato que compõe respostas imunes antifúngicas, este trabalho foi conduzido visando avaliar a ativação do inflamassoma por F. pedrosoi, bem como o seu papel na infecção induzida pelas formas saprofíticas do fungo. Foi observado, inicialmente, que hifas, ao contrário de conídios, induzem a secreção de IL-1 provendo os 2 sinais necessários à ativação do inflamassoma, tanto em BMDMs, quanto em BMDCs. O fornecimento exógeno do primeiro ou segundo sinal não só incrementou a secreção da citocina durante a infecção com hifas, como possibilitou a secreção de IL-1β por BMDCs infectadas com conídios. Utilizando inibidores ou células nocautes, verificou-se que a secreção de IL-1β é dependente do receptor NLRP3, da caspase-1, e influenciada pela caspase-8. Em adição, observamos que a secreção de IL-1 mediada pelo inflamassoma NLRP3 é dependente: da sinalização via NF-κB independente de MyD88; dos mecanismos de efluxo de K+; da liberação de catepsina B; e, de forma não essencial, da geração de espécies reativas de oxigênio. Ademais, foi mostrado que a melanina presente na parede do fungo, mas não a secretada, contribui para a secreção da IL-1. Foi demonstrado, ainda, que a caspase-1, caspase-11 e o receptor NLRP3, não foram capazes de promover a atividade fungicida de macrófagos em ensaios de co-cultura com o fungo. Entretanto, dados dos ensaios de infecções in vivo sugerem que as caspases-1 e -11, assim como o NLRP3, auxiliam na contenção da infecção por propágulos fúngicos de F. pedrosoi. No entanto, eles são dispensáveis na resposta à infecção com o conídio, confirmando o papel desta forma fúngica na persistência do F. pedrosoi no hospedeiro como resultado da ativação inadequada da resposta imune e seus mecanismos efetores.Fonsecaea pedrosoi is a dimorphic fungus, and the main etiologic agent of chromoblastomycosis, a chronic infection of the skin and subcutaneous tissue initiated after transcutaneous inoculation of saprophytic forms of the fungus. Inside the host, these cells turn into muriformes cells, considered the parasitic form, which produce large amount of melanin, an important virulence factor. Recent studies have suggested that the chronicity observed in chromoblastomycosis is due to both, failure in innate recognition of the fungus, leading to low production of pro-inflammatory cytokines, and development of an inappropriate immune response unable to contain the disease. In this context, and considering the inflammasome as an important innate recognition system that comprises antifungal immune responses, this study was conducted to evaluate inflammasome activation by F. pedrosoi, as well as its role in the infection induced by saprophytic forms of the fungus. First, it was observed that, in contrast to conidia, hyphae induced the secretion of IL-1, and provides both first and second signals for inflammasome activation in BMDMs and BMDCs. Exogenous stimulation of the first or second signal not only increased IL-1 secretion during infection with hyphae, but also enabled the secretion of IL-1 by BMDCs infected with conidia. Using inhibitors or knockout cells, it was found that IL-1β secretion is dependent on NLRP3, caspase-1 and influenced by caspase-8. In addition, we observed that IL-1 secretion mediated by NLRP3 inflammasome is dependent: on a NF-kB signaling pathway independent of MyD88; on efflux of K+; on cathepsin B release; and, in an unessential way, on generation of reactive oxygen species. Furthermore, it was demonstrated that melanin present in fungal cell wall, but not the secreted one, contribute to IL-1β secretion. It was further demonstrated that caspase-1, caspase-11 and NLRP3 receptor did not promote in vitro fungicidal activity of macrophages. However, data from in vivo infection studies suggest that caspase-1 and -11, as well as NLRP3, assist in the disease containment caused by infection with fungal propagules of F. pedrosoi. However, they are dispensable in response to infection with conidia, confirming the role of conidia in F. pedrosoi conidial form persistence in the host through the inappropriate activation of the immune response and its effectors mechanisms