Trichoderma reesein HFBI- ja HFBII-hydrofobiinien karakterisointi

Hydrophobins are surface active proteins produced by filamentous fungi. They fulfil a wide variety of functions in fungal growth and development. Properties and biological roles of the Trichoderma reesei hydrophobins HFBI and HFBII were studied in this work. In addition, the hydrophobins were crystallized and their effects on the bioreactor cultivation of T. reesei were evaluated. High production levels of HFBI and HFBII were obtained by introducing additional copies of the hfb1 or hfb2 genes into the genome of T. reesei. HFBI was produced up to 1.4 grams per liter, the highest production level of hydrophobin hitherto reported. HFBI and HFBII were purified and crystallized for structural analysis. Behaviour of the class II hydrophobins HFBI and HFBII and the class I hydrophobin SC3 of Schizophyllum commune was studied at various interfaces. All the hydrophobins were surface active. HFBI and HFBII reduced the surface tension of water faster than SC3. In contrast to SC3, self-assembly of HFBI and HFBII at water-air interfaces did not change the circular dichroism spectra. In electron microscopy, no clear ultrastructure of the dried class II hydrophobin film was observed, either. Differences are proposed to be due to the divergent size and shape of the hydrophobic parts of these proteins. Addition of Teflon changed the circular dichroism spectra of HFBI and HFBII, indicating formation of α helix structure. Both HFBI and SC3 rendered Teflon completely wettable. All the hydrophobins stabilized oil emulsions. The presence of HFBI or HFBII affected the solubility of SC3, indicating interaction between these hydrophobins. The hfb1 and hfb2 genes were deleted in T. reesei. The Δhfb1 strain formed no aerial hyphae in static liquid cultures. Addition of purified HFBI to the medium or expressing the gene encoding SC3 in the Δhfb1 strain restored the aerial hyphae formation. Colonies of Δhfb1 had a wettable and fluffy phenotype. In shaken liquid cultivation, biomass formation of Δhfb1 was slower compared with the parent strain. Sporulating colonies of Δhfb2 were wettable and sporulation was only 50% of that of the parent strain. These results indicate that HFBI facilitates aerial growth of T. reesei, whereas HFBII is involved in sporulation. The strains overproducing HFBI or HFBII foamed extensively in bioreactor cultivations, especially the HFBII-overproducing strain. Foaming of the Δhfb2 strain (but not Δhfb1) was lower compared with the parent. The main cause of foaming in the bioreactor cultivations of T. reesei Rut-C30 was shown to be HFBII.Hydrofobiinit ovat rihmamaisten sienten tuottamia pinta-aktiivisia proteiineja. Niillä on useita tehtäviä sienten kasvussa ja kehityksessä. Tässä työssä tutkittiin Trichoderma reesein HFBI- ja HFBII-hydrofobiinien ominaisuuksia ja biologisia rooleja. Lisäksi hydrofobiinit kiteytettiin, ja niiden vaikutusta T. reesein bioreaktorikasvatuksiin arvioitiin. Korkeat HFBI- ja HFBII-tuottotasot saavutettiin lisäämällä ylimääräisiä kopioita hfb1- tai hfb2-geenejä T. reesein perimään. HFBI:ä tuotettiin jopa 1,4 grammaa litraa kohden, mikä on korkein tähän mennessä raportoitu hydrofobiinin tuottotaso. HFBI ja HFBII puhdistettiin ja kiteytettiin rakenneanalyysiä varten. Luokan II hydrofobiinien HFBI ja HFBII sekä Schizophyllum communen luokan I hydrofobiinin SC3 toimintaa tutkittiin useilla rajapinnoilla. Kaikki hydrofobiinit olivat pinta-aktiivisia. HFBI ja HFBII alensivat veden pintajännityksen nopeammin kuin SC3. HFBI:n ja HFBII:n kerääntyminen vesi- ja ilmafaasien väliin ei muuttanut niiden CD-spektrejä, toisin kuin SC3:lla. Elektronimikroskopialla ei myöskään havaittu selkeää ultrarakennetta kuivuneilla HFBI- ja HFBII-hydrofobiinikalvoilla. Erojen ehdotetaan johtuvan näiden proteiinien hydrofobisten alueiden erilaisesta koosta ja muodosta. Teflonin lisäys muutti HFBI:n ja HFBII:n CD-spektriä viitaten α-kierrerakenteen muodostumiseen. Sekä HFBI että SC3 tekivät teflonista täysin kastuvan. Kaikki hydrofobiinit stabiloivat öljyemulsioita. HFBI:n tai HFBII:n läsnäolo vaikutti SC3:n liukoisuuteen, mikä viittaa näiden hydrofobiinien väliseen vuorovaikutukseen. T. reeseistä poistettiin hfb1- ja hfb2-geenit. Staattisissa nestekasvustoissa Δhfb1-kanta ei muodostanut ilmarihmoja. Puhdistetun HFBI:n lisääminen elatusaineeseen tai SC3-geenin ilmentäminen Δhfb1-kannassa palautti ilmarihmojen muodostumisen. Δhfb1-pesäkkeillä oli vettyvä ja pörröinen fenotyyppi. Ravistelluissa nestekasvatuksissa Δhfb1:n biomassan muodostus oli isäntäkantaa hitaampaa. Itiöivät Δhfb2-pesäkkeet olivat vettyviä ja itiöinti oli vain 50 % isäntäkannan itiöinnistä. Nämä tulokset osoittavat, että HFBI edesauttaa T. reesein kasvamista ilmaan, kun taas HFBII on osallisena itiöinnissä. HFBI:ä ja HFBII:a ylituottavat kannat vaahtosivat runsaasti bioreaktorikasvatuksissa, erityisesti HFBII:n ylituottokanta. Vaahtoaminen oli Δhfb2-kannalla (mutta ei Δhfb1:lla) isäntäkantaa heikompaa. HFBII:n osoitettiin olevan pääsyy vaahtoamiseen T. reesei Rut-C30:n bioreaktorikasvatuksissa.reviewe