Modificação genética de leveduras para a produção de bioetanol a partir de resíduos lenhocelulosicos

Dissertação de mestrado em BioengenhariaThe growing concern over the shortage of oil reserves, together with the need to preserve the environment, resulted in the search of viable alternative renewable sources for production of sustainable fuels such as 2nd generation bioethanol, produced from lignocellulosic biomass. The extraction of fermentable sugars from these lignocellulosic materials results in an undesirable release of inhibitory compounds, such as acetic acid and furfural, that have a negative impact on yeast growth and ethanol fermentation. Saccharomyces cerevisiae is the more suitable microorganism for genetic improvement of ethanol production however, S. cerevisiae is not able to metabolize xylose for its own growth or ethanol production which means that about 20 to 30% of lignocellulosic hydrolysate is not used. Furthermore, strains isolated from harsh industrial environments are naturally more robust and, depending on their genetic background, may respond differently to the presence of lignocellulosic-derived inhibitors. HAA1 and PRS3 genes have been described to improve yeast tolerance to lignocellulosic inhibitors. HAA1 overexpression have shown positive effects on yeast tolerance towards acetic acid in industrial strains fermentations carried out in glucose media and in laboratory strains fermentations in xylose media. PRS3 overexpression have been reported to increase industrial strains tolerance in glucose fermentations performed in real hydrolysate media. However, overexpression of HAA1 and/or PRS3 genes in industrial yeast strains capable of xylose fermentation in real lignocellulosic hydrolysates have never been attempted. Taking this into account, and using molecular biology tools, this study aimed to simultaneously overexpress HAA1 and/or PRS3 genes and insert a D-xylose metabolic pathway in PE-2ΔGRE3 and CA11, yeast strains with an industrial background; and evaluate their performance in aerobic growth and fermentation assays in the presence of lignocellulosic-derived inhibitors. The results obtained with these strains in aerobic growth tests and fermentation assays showed the effect of the overexpression of HAA1 and PRS3 increased PE-2ΔGRE3 capacity towards inhibitors in aerobic growth tests. Furthermore, in fermentations performed in xylose medium containing acetic acid and furfural, the overexpression of HAA1 and PRS3 in PE-2ΔGRE3 strains seem to increase yeast fermenting capacity comparing to the control strain. However, CA11 strains overexpressing both genes did not show increased abilities in the presence of lignocellulosic-derived inhibitors. These different performances showed that the overexpression of the same genes in strains with different background can lead to different outcomes. The overall results of this thesis highlight that the genetic engineering of industrial yeast isolates for improved production of 2nd generation bioethanol must be carefully addressed, and must rely in an integrative approach, considering the strain metabolic background, its capacity to consume xylose, and yeast tolerance towards inhibitors in real lignocellulosic hydrolysates.A crescente preocupação sobre a diminuição das reservas de petróleo e a necessidade de preservar o ambiente, levou à procura de alternativas viáveis para a produção de combustíveis sustentáveis como é o caso do bio etanol de 2º geração, combustível produzido a partir de biomassa lenhocelulósica. A extração de açucares fermentáveis a partir destes resíduos liberta uma série de compostos inibitórios, como ácido acético e furfural, que causam efeitos negativos no crescimento das leveduras e na produção de etanol. A Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais adequado para produção de etanol e para ser geneticamente modificado. Contudo, a S. cerevisiae não é capaz de metabolizar a xilose para o seu crescimento nem para a produção de etanol, o que significa que 20 a 30% dos compostos lenhocelulósicos não são usados. Estirpes isoladas de ambientes industriais são naturalmente mais robustas e dependendo do seu background podem responder de maneiras diferentes à presença de inibidores derivados da lenhocelulose. Já foi descrito que os genes HAA1 e PRS3 melhoram a tolerância das leveduras a estes inibidores. A sobreexpressão do HAA1 já mostrou efeitos positivos na tolerância das leveduras ao ácido acético em estirpes industriais em fermentações de glucose e em estirpes laboratoriais em meio com xilose. A sobreexpressão do PRS3 já foi associada ao aumento de tolerância de estirpes industriais em hidrolisados reais. Contudo, a sobreexpressão conjunta do HAA1 e do PRS3 em estripes industriais capazes de consumir xilose em fermentações com hidrolisados reais nunca foi realizada. Tendo isto em conta, e usando ferramentas de biologia molecular, o objetivo deste trabalho foi sobreexpressar simultaneamente o HAA1 e PRS3 e inserir uma via metabólica de consumo de xilose na PE-2ΔGRE3 e CA11, que são estirpes com um background industrial; e avaliar o seu desempenho em termos de crescimento aeróbio e em fermentações na presença de inibidores. Os resultados obtidos em ensaios de crescimento aeróbio mostraram que a sobreexpressão do HAA1 e do PRS3 aumentou a capacidade das estirpes de PE-2ΔGRE3 em termos de resistência aos inibidores. Nos ensaios das fermentações realizadas com esta estirpe em meio de xilose contendo ácido acético e furfural mostraram que a sobreexpressão dos dois genes parece aumentar a capacidade fermentativa das estirpes recombinantes em relação à estirpe controlo. Contudo, nos ensaios realizados com a estirpe CA11, a sobreexpressão dos dois genes não aumentou a capacidade fermentativa da levedura na presença de inibidores. Estes resultados demonstram que a sobreexpressão dos mesmos genes em estirpes diferentes pode levar a resultados diferentes. O resultado global deste trabalho realçou que a modificação genética de leveduras para melhorar a produção de etanol de 2º geração tem de assentar numa abordagem englobando o background de cada estirpe, a sua capacidade de consumir xilose e a sua tolerância a inibidores provenientes de hidrolisados reais