Preparation, Characterization And In Vitro Evaluation Of Multifunctional Magnetic Nanoparticles For Targeted Cancer Therapies

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Instıtute of Science and Technology, 2015Nanoteknoloji son zamanlarda ilaç endüstrisinde, teşhis ve tedavilerde, görüntüleme tekniklerinde, vücutta kontrollü ilaç salınımı ve ulaştırmada, doku mühendisliğinde, vs. kullanılmaya başlanılmıştır. Birçok farklı nanosistemlerden özellikle çok fonksiyonlu manyetik nanoparçacıklar (MNP) bu konuda çok ilgi çekmektedir. MNPlerin manyetik alan altında yönlendirilebilmesi özelliği diğer nanoparçacık sistemlerine göre daha avantajlı parçacıklar olmalarını sağlamaktadır. Yeni nesil tedavi yöntemlerinde sağlıklı hücrelere zarar vermeden ilaç ulaştırma, hedef kitleye tedavi için özellikle MNP kullanımları ve avantajları araştırılmaktadır. Dünya Saglık örgütünün yayımladığı istatistiklere göre önümüzdeki 20 yılda görülen kanser vakalarının 22 milyon gibi bir sayıya ulaşması beklenmektedir. Çok yaygın olarak görülen ve ölüm oranları yüksek olan bu hastalığın tedavi yöntemleri sadece kemoterapi, radyoterapi ve ameliyat ile sınırlıdır. Bu yöntemler yan etkisi çok olan ve invazif yöntemlerdir. Kanser tedavisi için en çok kullanılan yöntemlerden biri olan kemoterapi yönteminin en büyük dezavantajı spesifik olmaması ve tümör dokusu dışında sağlıklı hücrelere de zarar vermesidir. Bu yöntemlere alternatif olarak hedeflendirilmiş ilaçlar düşünülebilir. Bu parçacıklar lokalize halde istenilen bölgeye ulaştırılabilecegi için geleneksel tedavi yöntemlerinde görülen yan etkileri azaltabilir. Hedeflendirilmiş ilaçlar, seçilmiş etki bölgesi veya bölgelerinde en uygun etkileşmeyi sağlayabilmektedir. Ayrıca, etken maddenin dozunun azaltılabilmesine ve etken maddenin sadece hedef bölgeye dağılımıyla sınırlandırılmasına olanak sağlayabilmektedirler. Böylece oluşabilecek herhangi bir yan etki veya yan etkiler büyük oranda minimuma indirilebilecektir. Günümüzde, hedeflendirilmiş ilaç modeli için çok fonksiyonlu manyetik nanoparçacıkların (MNP) kullanılması araştırmacılar tarafından çok ilgi görmektedir. Bu parçacıklar gerekli modifikasyonlarla ilaç yüklenmeye uygun ve manyetik alan ile istenilen bölgeye ulaştırılabilnen parçacıklar haline getirilebilirler. Bu yöntem ile geleneksel kemoterapinin aksine sadece tümörlü hücrelere müdahale edilebilir ve ilaçların sağlıklı hücreleri etkisi azaltılabilir. MNP ile tümörlere üç farklı yol ile müdahale edilebilir. Bunlar: 1- hedef hücre tedavisi için MNP’lere ilaç yüklemesi, 2- tümörü MNP ile yüksek sıcaklıklara (dış manyetik alan etkisi ile) çıkararak yakmak, 3- spesifik biyomolekülleri MNP’lere bağlayarak tümörlere müdahale etmektir. Hedef hücrelere anti-tümör ajanları ulaştırarak tedavi etmek geleneksel kemoterapi yöntemine karşılık umut verici, alternatif bir yöntemdir. MNP olarak genelde demiroksitler, demir, kobalt gibi parçacıklar kullanılır. MNPler biyouyumlu olduğu düşünülse bile, vücuda alındığında toksik etki ve serbest radikal oluşumu gösterebilmektedir. Bu parçacıkların toksik etkisine sebep olan başlıca nedenlerden biri parçacıkların yüzey yükleridir. Ayrıca farklı bir dezavantaj ise MNPlerin kolloidal özelliklerinden dolayı stabil hale getirilmedilerse, bir araya toplanıp çökme eğilimleri olmasıdır. Bu dezavantaj parçacıkların vücut içine alındığında kan dolaşımına giremelerini engellemektedir ve çeşitli yan etkilere sebep olabilmektedir. Amaca uygun bir yapıda hedeflendirilmiş ilaç tasarımı yapabilmek için tasarım aşamasında yukarıda belirtilen tüm dezavantajlar göz önüne alınmalıdır. Çökme davranışını ve toksik etkilerini iyileştirmek biyopolimerler ile mümkündür. Bu etkilerin elimine edilmesi için yüzeylerinin biyolojik uyumlu hale getirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla MNP yüzeyleri biyopolimerler, grafen gibi malzemeler ile kaplanabilirler.Bu polimerler biyo uyumlu ve biyo çözünür oldukları için ilaç modellerinde kullanımı sentetik polimerlere göre daha avantajlıdır. Biyopolimerler ile kaplama diğer tekniklere göre daha ucuz ve kolay erişilebilinir bir yöntemdir ayrıca biyopolimerler anti tümör ilaç yüklemeleri ve parçacıkları stabil hale getirilmeleri için iyi bir altyapı sağlamaktadır. Toksik etkileri azaltmak için kullanılacak her bir MNP’nin tüm yüzeyinin biyopolimer ile kaplanması gerekmektedir. MNP’lerin kolloidal özellikleri belirlenerek kararlı parçacıklar elde etmek için gerekli biyopolimer konsantrasyonları seçilebilir. Burada istenilen MNP yüzeylerinin biyopolimerler ile tamamen kaplı ve kararlı yapılar olmasıdır. Reolojik ölçümler ile dispersiyonların akış özellikleri ve floküle olup olmadığı, magnetoreolojik ölçümlerle manyetik alan altındaki akış özellikleri, elektrokinetik ölçümler ile yüzeylerin kaplanıp kaplanmadığını, ışık saçılması deneyleri ile hidrodinamik yarıçaplarını, parçacık boyutlarını ve tüm bu yöntemlerin birlikte yorumlanması ile sistemin kararlı olup olmadığını belirleyebiliriz. Kararlı, yüzeyleri tamamen kaplı demir oksitlerin geleneksel karakterizasyonları ile görüntüleyebilir (Taramalı elektron mikroskopu (SEM), X-ışınları difraksiyonu (XRD), fourier transform infrared (FTIR) gibi yöntemler ve kolloidal karakterizasyon sonuçları desteklenebilir. Bunlar ile birlikte biyodemirlerin manyetik ve termal karakterizasyonları da önemli bilgiler taşırlar. Titreşimli numune magnetometresi (VSM), termal testleri (DSC, TGA) gibi testlerin yapılması biyopolimer kaplı demir oksitlerin manyetşk ve termal davranışlarını belirlemek için önemlidir. Karakterizasyonların ardından biyodemirlerin gerçekten canlı hücrelere zarar verip vermediği canlı dışı (in-vitro) hücre deneyleri ile kontrol edilebilir ve ilaç yüklemesi yapıldıktan sonra kanser hücrelerine etkisi gözlemlenebilir. Tez çalışmasındaki amaçlar; MNP olarak kullanacağımız demiroksit (Fe2O3) parçacıklarının üzerine literatürde henüz çalışılmamış olan hidroksietil selüloz (HEK) polimerini ve nanokristal yapıdaki ağaç fiberlerinden elde edilen selülozik polimeri (NK) kullanarak MNP parçacıklarının kolloidal özelliklerini takip ederek kararlı ve MNP parçacıklarının yüzeylerini tamamen kaplanmış numuneler elde etmek, polimerlere antitümör ajanları adsorbe ettirerek antikanser özellikli ve manyetik alan ile yönlendirilebilen nanoparçacıklar elde etmek ve hedeflendirilmiş ilaç literatürüne katkıda bulunmak, son olarak çağımızın hastalığı olan kanserin tedavisine yönelik çalışmalara katkıda bulunmak, literatürde kullanılmayan HEK ve selülozik polimerlerin kullanılması ile literatüre katkıda bulunmaktır. Belirtilen amaçlara ulaşmak için yapılması gerekenler; Sistemlerin akış özellikleri, zeta potansiyelleri ve parçacık boyutları bilgisi ile polimer konsantrasyonuna bağlı değişimlerini ve etkileşimlerini belirlemek, numunelerin yukarıda belirtilen geleneksel karakterizasyonları yapmak ve kolloidal karakterizasyon sonuçları ile uyumu araştırmak, biyopolimer kaplı demiroksitlerin sitotoksisitesi canlı dışı (in-vitro) hücre deneyleri ile araştırmak, toksik etkiyi minimuma indirmek, in vitro deneyler ile sağlıklı hücreler ile etkileşimlerini belirleyerek kullandığımız biyopolimerlerin bu tip uygulamalar için uygunluğunu kontrol etmek ve son olarak biyopolimer kaplı demir oksitlere antitümör ajanlar yüklenerek ve yine in-vitro sitotoksisite deneyleriyle kanserli hücreler üzerindeki etkisi araştırmaktır. Bu basamakları uygulayarak belirtilen tüm deneyler yapılmıştır ve sonuçları tezde açıklanmıştır. Deney sonuçlarına göre sentezlediğimiz çok fonksiyonlu manyetik nanoparçacıkların kanser tedavisi için kullanılabilecek hedeflendirilmiş ilaç olabilmeye uygun parçacıklar olduğu söylenebilir ve ileride yapılacak terepâtik ilaç tasarımlarıyla ilgili çalışmalara yardımcı olacak bilgiler sağlayabilecegi söylenebilmektedir. Çalışmalarımızın devamında sentezlediğimiz parçacıkların in vivo (canlı içi) testlerindeki davranışlarını araştırmak istemekteyiz.According to World Health Organization’s statistics, it is expected that annual cancer cases will rise from 14 million in 2012 to 22 within the next 2 decades. Most common clinically used cancer treatments are surgery, chemotherapy, radiation therapy etc. However, these treatment options can be invasive and have many side effects. The major disadvantage of most chemotherapeutic approaches for cancer treatment is that they are non-specific for tumor tissue, hence toxicity to healthy cells and manifestation of side effects. To overcome these disadvantages, a new approach of using multifunctional magnetic nanoparticles (MNP) can eliminate the disadvanteges of traditional treatments. Popularly researched MNPs are iron oxides such as magnetite, maghemite, hematite and geothite for designing a multifunctional magnetic nanoparticle that can deliver drug to the target site. Recently, iron oxide nanoparticles (IONPs) have shown great potential in therapeutic and diagnostic applications, such as imaging, magnetic hyperthermia treatments and drug delivery systems. IONPs, biocompatibility in moderate doses, easy of surface modification, known metabolic pathways, variety of their sizes and their magnetic properties allow them to be suitable for therapeutic applications. These properties and their ability to be manipulated upon application of a magnetic field allow them to be utilized as therapeutic and diagnostic tools. Iron oxide nanoparticles have been widely used in preclinical experiments for imaging, magnetic hyperthermia and drug delivery. Besides the advantages mentioned above, IONPs also might cause cytotoxicity and can form free radicals in the system. For this reason, these particles must be modified to reduce these effects. One of the most sensitive parameters in toxicity is the surface coating of the nanoparticles. To induce lower toxicity, nanoparticles can be coated with biocompatible coating, which is an easier, cheaper method comparing to synthetic polymers. Also loading anti tumor drugs to MNPs surface is challenging without the help of an polymer.so using biocompatible biopolymers for the functionalization of nanoparticles by modulating physical and chemical properties (surface charge, etc.) improving stability, reducing toxicity and protection of drugs and nanoparticles may eliminate existing disadvantages. Also evaluating the toxicological effects of MNPs both in vitro and in vivo is crucial for the development of MNPs. Therefore, this research reports the synthesis, characterization, and in vitro evaluations of multifunctional magnetic iron oxide nanoparticles coated with biopolymers. This reported nanodrug system could potentially open up new possibilities in the design of therapeutic agents using multifunctional nanoparticles. When designing and synthesizing multifunctional nanoparticles all advantages and disadvantades previously mentioned must be considered. To reach a positive result characterization, optimum polymer concentration determination is important. Optimum concentration of the biopolymers can be determined by characterization of the colloidal properties of the MNP particles. The desired MNP-biopolymer structure suitable for targeted drug delivery must have fully covered surfaces by the biopolymers and stabile structures. The flocculation properties of MNPs can be determied by their rheological measurements and the surface properties can be determied by their electrokinetical measurements. The hydrodynamic radius of the MNPs can be controlled by the light scattering experiments. Characterization provides an opportunity to analyze the results of experiments and to choose the next step to achieve expected results. Characterization techniques are required to determine magnetic nanoparticle properties such as size, crystal structure, material’s thermal stability, absorbtion spectrum and magnetic behavior. Characterization of nanostructured materials is important because human eye cannot determine such small structures and their properties. The stabile and fully covered surfaces of the MNPs were characterized by the conventional methods such as scanning electron microscope (SEM) for the determination of the size and morphology, X-ray diffraction (XRD) to determine crystal structure, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) to analyze the chemical bonds and functional groups, thermogravimetric analysis (TGA) to determine material’s thermal stability and vibrating sample magnetometers (VSM) to measure the magnetic properties.After the characterization of MNP, the in vitro evaluations will give insight about biological compatibility and toxicity of synthesized particles. The only possibility of the targeted drug delivery of magnetic particles is to apply external magnetic field. However, when an external magnetic field is applied there is a drastic change on the flow properties of the magnetic suspensions. The magnetorheological effect of the drug delivery MNPs are rarely researched in the literature and very important considering the applications. In this study we examined MNPs magnetorheological properties. The main purposes this project is to have stable and fully covered surfaces of Fe2O3 particles by coating with HEC and cellulosic polymers and to obtain non-toxic biocompatible multifunctional magnetic particles. When particles reach desired properties cancer drugs will be adsored on the particles and the effect of these particles on the cancer cells will be examined. To achieve the goals mentioned above Fe2O3 particles were treated with biopolymers in a variable range of polymer concentration. Particles with optimum polymer concentrations were characterized and tested for toxicity. The reported nanodrug system in this thesis showed that multifunctional nanoparticles synthesized could potentially open up new possibilities in the design of therapeutic agents using them. Future efforts could be to investigate the in vivo characteristics of these integrated nanostructures.Yüksek LisansM.Sc